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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒DNA提取成了这样，请大家帮忙分析一下
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rollandyoung

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒DNA提取成了这样，请大家帮忙分析一下

一、试验内容：
1. 质粒pCAMBIA1301DNA提取
2. 对提取的质粒DNA根据质粒图谱上的酶切位点进行验证性的酶切，所用酶Xho1。
3. 根据一篇已发表的论文所用的引物序列设计引物，进行验证性的PCR扩增。
二、主要试验材料：含有质粒的大肠杆菌（已经液体LB培养基摇菌16小时）
三、方法：参照分子克隆实验指南第三版 方案一 SDS碱裂解法制备质粒DNA：小量制备
四、结果：1.质粒DNA见电泳照片
          2.酶切产物经电泳显示无酶切产物出现
          3. PCR扩增无扩增产物出现
问题：
综合上述结果，使我对我提取的质粒DNA的质量产生了疑问，总结了以下问题
1. 我知道正常的质粒DNA电泳应该能够呈现出很亮且较宽的带型，这种情况属于正常吗？大家是否以前也遇到过这样的问题，是怎样解决的？
2. 质粒DNA提取过程中有哪些需要注意的地方？
3. 提取质粒DNA用到的试剂有特殊的要求和需要注意的地方吗？
4. 除上述问题外还有哪些需要注意和改进的地方？

已经被这个问题困扰了整个假期了，严重地影响了下一步的试验进程，故求助的心情十分之迫切，希望大家不吝赐教，在此先行谢过！
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1楼 2011-08-29 10:45:40
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
pcr和酶切我全都做了，但是都没做出来，正因为如此我才怀疑是质粒的提取问题，感谢你的建议。
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4楼2011-08-29 18:56:48
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sfb1020 at 2011-09-01 16:27:55:
我们实验室就用分子克隆的方法，没有问题的。你提的质粒做RNA酶消化了吗？酶消化后还要去除RNA酶，否则可能会对PCR和酶切有影响。

嗯，我是用了RNA酶的，不过没有去除RNA酶，多谢提醒。
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11楼2011-09-01 21:14:14
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by character at 2011-09-01 17:21:28:
pCAMBIA1301是低拷贝的载体 不太容易操作。提取质粒时一定要用氯仿把中酚抽干净 以免影响限制性内切酶和Taq酶的活性。

请问怎样将酚抽提干净呢？
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12楼2011-09-01 21:16:53
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-09-01 16:56:29:
1、查了一下，你这个载体很大诶，8000-10000kD吧。你用的marker太小了，可以换一下1K(最大为10000kD)的marker。
2、抽质粒跑胶图带的大小不是很准确，单酶切后大小就准确了。
3、你做了单酶切是什么结果啊，酶切 ...

感谢你的帮助
关于酶切我做了一下工作，请帮忙分析
一、内切酶：我用的是Xho 1，在pCAMBIA上有两个酶切位点，按照质粒图谱上的酶切位点，应该可以切下来大概1000bp的小片段。（质粒图谱如图所示）
二、反应体系：Xho 1              2ul
                     10XH Buffer     4ul
                     质粒DNA         10ul
                     娃哈哈灭菌水    4ul
                     总体积             20ul
反应条件：37度 3小时
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13楼2011-09-01 21:30:27
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
好的，今天我就换个marker试一下，感谢你的建议和帮助！
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15楼2011-09-02 08:32:10
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by keyasyie at 2011-09-02 10:46:11:
你的酶切反应体系有问题，buffer和质粒加的都太多了 。按照内切酶的说明书重新设计下反应体系吧。

1. 之前按照说明书的反应体系我做过，电泳显示无酶切片段。
2. buffer是按照说明书的要求加的，质粒DNA的量确实是多了一些，原因是我提的质粒DNA就不亮，所以我把质粒的反应量提高了。
3. 继续求助，呵呵！
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17楼2011-09-02 12:32:40
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
非常感谢楼上的建议和帮助！
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20楼2011-09-02 17:06:55
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by yixinyuan at 2011-09-02 22:02:17:
大凡对地拷贝的打质粒抽提都不太好做。从图看应该是抽提的量低了些，应该再更换溶液多做做看

你好，感谢你的建议。能具体说一下重点更换哪些溶液吗？多谢！
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22楼2011-09-03 14:52:04
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
感谢楼上两位的的建议，多谢支持，论坛因为有你们而美丽！
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25楼2011-09-03 18:34:14
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