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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒DNA提取成了这样，请大家帮忙分析一下
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sfb1020 at 2011-09-01 16:27:55:
我们实验室就用分子克隆的方法，没有问题的。你提的质粒做RNA酶消化了吗？酶消化后还要去除RNA酶，否则可能会对PCR和酶切有影响。

嗯，我是用了RNA酶的，不过没有去除RNA酶，多谢提醒。
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11楼2011-09-01 21:14:14
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by character at 2011-09-01 17:21:28:
pCAMBIA1301是低拷贝的载体 不太容易操作。提取质粒时一定要用氯仿把中酚抽干净 以免影响限制性内切酶和Taq酶的活性。

请问怎样将酚抽提干净呢？
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12楼2011-09-01 21:16:53
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-09-01 16:56:29:
1、查了一下，你这个载体很大诶，8000-10000kD吧。你用的marker太小了，可以换一下1K(最大为10000kD)的marker。
2、抽质粒跑胶图带的大小不是很准确，单酶切后大小就准确了。
3、你做了单酶切是什么结果啊，酶切 ...

感谢你的帮助
关于酶切我做了一下工作，请帮忙分析
一、内切酶：我用的是Xho 1，在pCAMBIA上有两个酶切位点，按照质粒图谱上的酶切位点，应该可以切下来大概1000bp的小片段。（质粒图谱如图所示）
二、反应体系：Xho 1              2ul
                     10XH Buffer     4ul
                     质粒DNA         10ul
                     娃哈哈灭菌水    4ul
                     总体积             20ul
反应条件：37度 3小时
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13楼2011-09-01 21:30:27
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xbl3688

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-09-02 06:57:07
引用回帖:
13楼: Originally posted by rollandyoung at 2011-09-01 21:30:27:
感谢你的帮助
关于酶切我做了一下工作，请帮忙分析
一、内切酶：我用的是Xho 1，在pCAMBIA上有两个酶切位点，按照质粒图谱上的酶切位点，应该可以切下来大概1000bp的小片段。（质粒图谱如图所示）
二、反应体 ...

1、我就怀疑你的Marker用的太小了，你抽的质粒有可能是对的，因为酶切后的条带比较单一，换大一点的Marker，确定条带大小，排除总DNA的可能；
2、1000bp的带不清楚，一个可能是酶的量多了，另一个可能是时间长了点。因为后边产生抹带，很有可能是酶切时间长了，可以重复一遍，用2ul的酶，在酶切的第二小时的时候取样跑胶检测一下。
祝你好运！~
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
14楼2011-09-01 22:27:06
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
好的，今天我就换个marker试一下，感谢你的建议和帮助！
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15楼2011-09-02 08:32:10
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keyasyie

铁虫 (初入文坛)
西瓜: 鼓励新虫 2011-09-02 11:03:11
你的酶切反应体系有问题，buffer和质粒加的都太多了 。按照内切酶的说明书重新设计下反应体系吧。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

rollandyoung
16楼2011-09-02 10:46:11
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by keyasyie at 2011-09-02 10:46:11:
你的酶切反应体系有问题，buffer和质粒加的都太多了 。按照内切酶的说明书重新设计下反应体系吧。

1. 之前按照说明书的反应体系我做过，电泳显示无酶切片段。
2. buffer是按照说明书的要求加的，质粒DNA的量确实是多了一些，原因是我提的质粒DNA就不亮，所以我把质粒的反应量提高了。
3. 继续求助，呵呵！
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17楼2011-09-02 12:32:40
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-02 18:20:12
提质粒没那么严格的，挺容易提出来的。直接加ＲＮＡ酶水溶解，３７度２０分钟就行了。后续实验没影响。或者用试剂盒也行，我们用的试剂盒效果觉得提的比较纯，但高度没自配溶液高。酶切的话你设个正对照吧，说不定是酶的问题。
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18楼2011-09-02 15:40:51
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zgb1982

木虫 (正式写手)
不是高度，是亮度
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19楼2011-09-02 15:41:30
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
非常感谢楼上的建议和帮助！
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20楼2011-09-02 17:06:55
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