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rollandyoung

金虫 (小有名气)

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8楼: Originally posted by sfb1020 at 2011-09-01 16:27:55:
我们实验室就用分子克隆的方法,没有问题的。你提的质粒做RNA酶消化了吗?酶消化后还要去除RNA酶,否则可能会对PCR和酶切有影响。

嗯,我是用了RNA酶的,不过没有去除RNA酶,多谢提醒。
11楼2011-09-01 21:14:14
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rollandyoung

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by character at 2011-09-01 17:21:28:
pCAMBIA1301是低拷贝的载体 不太容易操作。提取质粒时一定要用氯仿把中酚抽干净 以免影响限制性内切酶和Taq酶的活性。

请问怎样将酚抽提干净呢?
12楼2011-09-01 21:16:53
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rollandyoung

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-09-01 16:56:29:
1、查了一下,你这个载体很大诶,8000-10000kD吧。你用的marker太小了,可以换一下1K(最大为10000kD)的marker。
2、抽质粒跑胶图带的大小不是很准确,单酶切后大小就准确了。
3、你做了单酶切是什么结果啊,酶切 ...

感谢你的帮助
关于酶切我做了一下工作,请帮忙分析
一、内切酶:我用的是Xho 1,在pCAMBIA上有两个酶切位点,按照质粒图谱上的酶切位点,应该可以切下来大概1000bp的小片段。(质粒图谱如图所示)
二、反应体系:Xho 1              2ul
                     10XH Buffer     4ul
                     质粒DNA         10ul
                     娃哈哈灭菌水    4ul
                     总体积             20ul
反应条件:37度 3小时



13楼2011-09-01 21:30:27
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xbl3688

银虫 (正式写手)

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-09-02 06:57:07
引用回帖:
13楼: Originally posted by rollandyoung at 2011-09-01 21:30:27:
感谢你的帮助
关于酶切我做了一下工作,请帮忙分析
一、内切酶:我用的是Xho 1,在pCAMBIA上有两个酶切位点,按照质粒图谱上的酶切位点,应该可以切下来大概1000bp的小片段。(质粒图谱如图所示)
二、反应体 ...

1、我就怀疑你的Marker用的太小了,你抽的质粒有可能是对的,因为酶切后的条带比较单一,换大一点的Marker,确定条带大小,排除总DNA的可能;
2、1000bp的带不清楚,一个可能是酶的量多了,另一个可能是时间长了点。因为后边产生抹带,很有可能是酶切时间长了,可以重复一遍,用2ul的酶,在酶切的第二小时的时候取样跑胶检测一下。
祝你好运!~
生活的乐趣在于善于发现美,学会欣赏美
14楼2011-09-01 22:27:06
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rollandyoung

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
好的,今天我就换个marker试一下,感谢你的建议和帮助!
15楼2011-09-02 08:32:10
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keyasyie

铁虫 (初入文坛)

西瓜: 鼓励新虫 2011-09-02 11:03:11
你的酶切反应体系有问题,buffer和质粒加的都太多了 。按照内切酶的说明书重新设计下反应体系吧。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

16楼2011-09-02 10:46:11
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rollandyoung

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by keyasyie at 2011-09-02 10:46:11:
你的酶切反应体系有问题,buffer和质粒加的都太多了 。按照内切酶的说明书重新设计下反应体系吧。

1. 之前按照说明书的反应体系我做过,电泳显示无酶切片段。
2. buffer是按照说明书的要求加的,质粒DNA的量确实是多了一些,原因是我提的质粒DNA就不亮,所以我把质粒的反应量提高了。
3. 继续求助,呵呵!
17楼2011-09-02 12:32:40
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zgb1982

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-02 18:20:12
提质粒没那么严格的,挺容易提出来的。直接加RNA酶水溶解,37度20分钟就行了。后续实验没影响。或者用试剂盒也行,我们用的试剂盒效果觉得提的比较纯,但高度没自配溶液高。酶切的话你设个正对照吧,说不定是酶的问题。
18楼2011-09-02 15:40:51
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zgb1982

木虫 (正式写手)

不是高度,是亮度
19楼2011-09-02 15:41:30
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rollandyoung

金虫 (小有名气)

非常感谢楼上的建议和帮助!
20楼2011-09-02 17:06:55
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