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rollandyoung

金虫 (小有名气)

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[求助] 质粒DNA提取成了这样，请大家帮忙分析一下

一、试验内容：
1. 质粒pCAMBIA1301DNA提取
2. 对提取的质粒DNA根据质粒图谱上的酶切位点进行验证性的酶切，所用酶Xho1。
3. 根据一篇已发表的论文所用的引物序列设计引物，进行验证性的PCR扩增。
二、主要试验材料：含有质粒的大肠杆菌（已经液体LB培养基摇菌16小时）
三、方法：参照分子克隆实验指南第三版方案一 SDS碱裂解法制备质粒DNA：小量制备
四、结果：1.质粒DNA见电泳照片
2.酶切产物经电泳显示无酶切产物出现
3. PCR扩增无扩增产物出现
问题：
综合上述结果，使我对我提取的质粒DNA的质量产生了疑问，总结了以下问题
1. 我知道正常的质粒DNA电泳应该能够呈现出很亮且较宽的带型，这种情况属于正常吗？大家是否以前也遇到过这样的问题，是怎样解决的？
2. 质粒DNA提取过程中有哪些需要注意的地方？
3. 提取质粒DNA用到的试剂有特殊的要求和需要注意的地方吗？
4. 除上述问题外还有哪些需要注意和改进的地方？

已经被这个问题困扰了整个假期了，严重地影响了下一步的试验进程，故求助的心情十分之迫切，希望大家不吝赐教，在此先行谢过！

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rollandyoung

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1楼 2011-08-29 10:45:40

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xbl3688

银虫 (正式写手)

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★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-09-02 06:57:07

引用回帖:

13楼: Originally posted by rollandyoung at 2011-09-01 21:30:27:
感谢你的帮助
关于酶切我做了一下工作，请帮忙分析
一、内切酶：我用的是Xho 1，在pCAMBIA上有两个酶切位点，按照质粒图谱上的酶切位点，应该可以切下来大概1000bp的小片段。（质粒图谱如图所示）
二、反应体 ...

1、我就怀疑你的Marker用的太小了，你抽的质粒有可能是对的，因为酶切后的条带比较单一，换大一点的Marker，确定条带大小，排除总DNA的可能；
2、1000bp的带不清楚，一个可能是酶的量多了，另一个可能是时间长了点。因为后边产生抹带，很有可能是酶切时间长了，可以重复一遍，用2ul的酶，在酶切的第二小时的时候取样跑胶检测一下。
祝你好运！~