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造血干细胞铜虫 (初入文坛)
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转质粒不成功,好几次了,大家给分析一下问题会出在哪里
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| 目前在做质粒构建,问题是,载体酶切,片段酶切之后连接转化涂板总是什么都不长,试过电转,DH4a转,都没有成功,我之前没怎么做过,实在不清楚问题出在哪里,求高手指教 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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2楼2011-08-23 18:03:04
3楼2011-08-23 18:06:27
blackrose8089
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4楼2011-08-23 20:42:49
空谷幽风
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
造血干细胞(金币+1): 片段是pcr扩出来的,当时特异性都不错,是双酶切不错,根据你说的我估计是酶切没切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18
造血干细胞(金币+1): 片段是pcr扩出来的,当时特异性都不错,是双酶切不错,根据你说的我估计是酶切没切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18
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先转个完整的载体质粒看看长不长，不长的话就是感受态或者操作的问题，如果长就要从酶切方面考虑，载体和片段是不是都完全酶切了： （1）载体如果是双酶切，建议你先用两种酶分别单切，看看是否都能切开 （2）片段如果是从质粒上切下来的，那应该问题不大；如果是酶切的PCR产物，请确认保护碱基的数量是否足够，一般每个位点有5个保护碱基比较保险 |
5楼2011-08-23 21:05:32
天使托
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 专家就是专家 2011-08-23 23:06:38
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 专家就是专家 2011-08-23 23:06:38
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很明显主要原因应该是连接的问题了 1：你的载体和基因酶切是否完全，尤其是载体，酶切出来的条带要单一；还有就是载体和基因酶切完全后，要纯化完全，不然很影响后期连接酶的效率的； 2：连接体系的设置，可以根据你载体和目的片段的大小，以及纯化跑电泳出来的浓度进行定量，然后确定连接体系中载体添加多少，基因添加多少，这一步其实也很关键，如果体系中各反应物不合适，那做一个克隆就比较难成功； 3：转化，感受态细胞效率如何？筛选标记中如何（比如抗生素，抗生素抗性，浓度等等） 4：一般24h之内只要长出来应该问题不大，如果超过24h了基本就over了 一步一步检查一下，看看哪一步问题比较大。。。然后再寻找解决对策！ 祝你好运！ |
6楼2011-08-23 21:44:05
造血干细胞
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7楼2011-08-24 10:06:46
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9楼2011-08-24 11:03:44
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