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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转质粒不成功,好几次了,大家给分析一下问题会出在哪里
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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)

[求助] 转质粒不成功,好几次了,大家给分析一下问题会出在哪里

目前在做质粒构建,问题是,载体酶切,片段酶切之后连接转化涂板总是什么都不长,试过电转,DH4a转,都没有成功,我之前没怎么做过,实在不清楚问题出在哪里,求高手指教
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1楼2011-08-23 17:03:33
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 是要认真的 2011-08-23 19:11:55
质粒有没有特殊性，有没有做阳性对照？还是仔细的做好每步工作
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3楼2011-08-23 18:06:27
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 是需要考虑，鼓励交流 2011-08-23 19:11:44
原因可能有很多，感受态细胞是否不行？连接是否成功？
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2楼2011-08-23 18:03:04
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

实在不行的话，楼主能不能考虑让师兄姐妹代做一下看看！
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jiayoubashaonian
4楼2011-08-23 20:42:49
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
造血干细胞(金币+1): 片段是pcr扩出来的,当时特异性都不错,是双酶切不错,根据你说的我估计是酶切没切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18
先转个完整的载体质粒看看长不长，不长的话就是感受态或者操作的问题，如果长就要从酶切方面考虑，载体和片段是不是都完全酶切了：
（1）载体如果是双酶切，建议你先用两种酶分别单切，看看是否都能切开
（2）片段如果是从质粒上切下来的，那应该问题不大；如果是酶切的PCR产物，请确认保护碱基的数量是否足够，一般每个位点有5个保护碱基比较保险
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5楼2011-08-23 21:05:32
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