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shiliu2011

木虫 (正式写手)

[交流] 什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 已有5人参与

什么是限制性内切核酸酶的星号活性?双酶切选择buffer时，是应该选没有星号活性的效率较低的buffer OR 效率为100带有星号活性的buffer？为什么？
     本人是新手，还望各位高级别的虫子赐教！谢谢！
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1楼 2011-12-28 10:34:45
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c3024034

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
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wanhscn(金币+2): 鼓励交流！good 2011-12-28 12:54:37
：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星   活性。  
   概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：
(1)高甘油含量(>5％, v／v)；
(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；
(3)低离子强度(<25 mmol／L)；
(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；
(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等

选用效率为100带有星号活性的buffer，
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2楼2011-12-28 11:20:44
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shiliu2011

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by c3024034 at 2011-12-28 11:20:44:
：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称 ...

还是不太懂。。。。星号活性就是酶切位点发生改变了呀，那选择100带有星号活性的buffer，不是就会导致错切嘛？
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鎴戜滑鎬绘槸澶繃浜庡湪涔庝竴鏃剁殑寰楀け锛屽?村繕璁颁簡鎴?闀挎�?鏄渶閲?瑕?鐨�
3楼2011-12-28 14:30:03
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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3楼: Originally posted by shiliu2011 at 2011-12-28 14:30:03:
还是不太懂。。。。星号活性就是酶切位点发生改变了呀，那选择100带有星号活性的buffer，不是就会导致错切嘛？

2楼已经说了发生星号活性的几个因素，你按照说明书介绍的正常酶切条件，是不会有星号活性的啦。
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4楼2011-12-28 14:58:53
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shiliu2011

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-12-28 14:58:53:
2楼已经说了发生星号活性的几个因素，你按照说明书介绍的正常酶切条件，是不会有星号活性的啦。

关键是做双酶切的时候，要用两种酶的共同的buffer，就涉及到上面的问题。。。所以才困惑了
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5楼2011-12-28 15:25:15
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
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wanhscn(金币+2): 很清楚！ 2011-12-29 08:49:01
引用回帖:
5楼: Originally posted by shiliu2011 at 2011-12-28 15:25:15:
关键是做双酶切的时候，要用两种酶的共同的buffer，就涉及到上面的问题。。。所以才困惑了

双酶切也一样啊。你看看是哪个酶在那个buffer可能有星号活性，参照说明书对该酶星号活性的说明。一般就是酶过量（几倍到几十倍的情况）或者酶切时间过长会出问题。
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6楼2011-12-28 15:57:05
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sususimple

金虫 (初入文坛)
★
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建议选用没有星号活性，而且两个酶都能保持较高酶切效率的buffer。若实在是某个酶效率太低，可以分两次酶切。
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7楼2011-12-29 08:44:25
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shiliu2011

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by sususimple at 2011-12-29 08:44:25:
建议选用没有星号活性，而且两个酶都能保持较高酶切效率的buffer。若实在是某个酶效率太低，可以分两次酶切。

分两次酶切，buffer体系不一样了，必须得纯化以后在进行第二次酶切吧？
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鎴戜滑鎬绘槸澶繃浜庡湪涔庝竴鏃剁殑寰楀け锛屽?村繕璁颁簡鎴?闀挎�?鏄渶閲?瑕?鐨�
8楼2011-12-29 09:17:47
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小东的东东

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-12-29 16:38:15
不需要纯化再酶切。你可以先用其中一个酶在10ul体系底下反应，然后加第二个酶的时候把反应体系加大到20ul进行酶切，这样就相当于把第一步反应的缓冲液稀释了
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2014，新的起点！
9楼2011-12-29 10:18:58
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laokuang1988

铜虫 (小有名气)
★
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9楼: Originally posted by 小东的东东 at 2011-12-29 10:18:58:
不需要纯化再酶切。你可以先用其中一个酶在10ul体系底下反应，然后加第二个酶的时候把反应体系加大到20ul进行酶切，这样就相当于把第一步反应的缓冲液稀释了

对不起，我想问一下，是不是直接将第一次酶切的10微直接加入第二次酶切体系，是最终体积到达20微
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10楼2011-12-29 19:51:49
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