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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!讲得很清楚了! 2011-07-02 16:48:36
xuqingchun33(金币+1): 2011-07-03 12:49:56
引用回帖:
Originally posted by xuqingchun33 at 2011-07-02 11:26:42:
各位大侠,请问一下下面的这个双酶切体系是什么意思?能否举个例子,谢谢
Double Digestion with BamHI, NdeI
We recommend:
Buffer 2X Tango?
2-fold excess of BamHI
2-fold excess of NdeI
Incubate at  ...

一看就知道楼主用的是fermentas公司的限制性内切酶。
Double Digestion with BamHI, NdeI就是选择的酶是BamHI, NdeI。
We recommend:
Buffer 2X Tango该公司推荐使用的酶切缓冲液是2X Tango,就是加酶切体系总体积的1/5的10X Tango。
2-fold  excess of BamHI
2-fold excess of NdeI因为这两个酶在2X Tango条件下活性都只有50-100%,不是100%,为了保证切割效率,所以加入的酶量是2倍。
Incubate at 37°C 这个就是酶切温度了。
4楼2011-07-02 16:09:34
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智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, EPI+1): 很有经验啊!酶的用量是可以省一些,大不了切久点就好了。很多酶在1X和2X tango中活性差别很大,可根据Fermentas那个表,用1X时就加总体积1/10的10X tango,用2X时就加1/5. 2011-07-02 21:02:51
xuqingchun33(金币+1): 2011-07-03 12:50:07
放培养箱和水浴锅没有什么影响,只要保证在这个温度下酶的效率是最大发挥的就没有什么问题,有时候室内温度高,可以达到30几度,照样室温进行酶切;

另外buffer 2x tango,就是1/5的比例,就是总体积的五分之一,50ul体系的话添加10ul ,一般如果没有特殊说明的话就是1/10,加5ul;

至于酶,也就是按照原体系量的二倍来加,因为两种酶的活性在此条件和buffer下不是很高,很有可能是50%,比如50ul体系,加2ul,现在加4ul,其实个人认为具体实验中加2ul就可以了,不需要加那么多酶,浪费。。。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2011-07-02 20:52:28
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