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hutingting

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR引物设计出来了,但酶切之后电泳没条带啊 已有10人参与

这是我设计的引物,前引物:5-GGG AAA TCT AGA CTC GTA GTA TCG GTT G-3其中TCT AGA是酶切位点,后引物:5-GG GTT GAT  CAG GAT CCC GTG -3,其中GGATCC是酶切位点,我的序列中包括酶切位点,PCR之后,琼脂糖凝胶电泳的条带很弱,再做酶切之后,就没有条带了,我是做PCR之后,酶切,连接,做感受态细胞的转化,请教各位高手是不是我引物设计的有问题,谢谢啦
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)


hutingting(金币+3):谢谢参与
引物酶切位点最好靠近5‘端,要加保护碱基
PCR之后,如果琼脂糖凝胶电泳的条带很弱,完全没别要再酶切,连接,感受态细胞的转化。
建议重新设计引物!
10楼2010-06-22 21:10:21
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lly198784

木虫 (正式写手)


hutingting(金币+3):谢谢参与
应该不是引物的问题,因为你PCR出来了,看看是不是PCR体系的问题!
2楼2010-06-22 11:22:08
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buster

新虫 (初入文坛)


hutingting(金币+3):谢谢参与
会不会是酶切的问题呢。pcr之后条带很弱,酶切体系控制不好的话,没有条带很正常呢。为什么不多P几管合一起纯化后再酶切呢
3楼2010-06-22 11:56:00
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ququr008

金虫 (小有名气)

★ ★
hutingting(金币+3):谢谢参与
lstt09nk(金币+1):很热心~~ 2010-06-22 13:57:43
你需要解决如下几个问题:1、带是否确信是你需要的条带?巢式PCR可以确认。2、带比较弱的问题。放大量扩增;调整扩增温度;调整PCR体系;(不推荐二次PCR)。3、检查酶切位点后面的保护碱基是否数量足够,或者是否合适?查一下PCR实验指南上面好像有一个大表,对每一个酶都有说明。4、感受态是否质量足够好?做一下检测,参照坛子里面相关内容。

[ Last edited by ququr008 on 2010-6-22 at 12:43 ]
4楼2010-06-22 12:41:56
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