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thinkerboy

铁虫 (小有名气)

[求助] 怎么确定变性和退火温度

我反转录成cDNA第一链后，以cDNA第一链为模板进行PCR反应，该怎么设置循环条件，需要94℃预变性么退火温度怎么确定，我用的是invitrogen合成的引物，它给了两个退火温度，一个是1M Na+ 的TM为66.5和67.9值，另一个是50mM Na+的TM为44.9和46.3值，这该怎么确定他的退火温度。

[ Last edited by thinkerboy on 2013-1-2 at 22:54 ]
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1楼 2013-01-02 22:52:15
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yaohuaibing

铁杆木虫 (著名写手)
pcr条件根据你用的酶，taq酶94或95  star96 ，一般30循环。退火文都一般不考虑引物的文都 56-58都可以试试，如果有杂带，建议提高退火温度即可
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每天都在读书和读人。书易懂，人难解。
6楼2016-06-09 23:08:15
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
变性温度根据酶来定
一般的酶94度95度都可以 有的比如Phusion要98度 看说明书
退火温度看引物
一般退火温度是Tm-5度 因为Tm计算方法不同有时也不必太在意 普通长度的PCR引物退火温度在55到65度之间 上手不愿意做退火温度梯度的话可以先用55度扩 有杂带的话再提高
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2楼2013-01-02 23:26:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
以cDNA为模板的PCR和普通用genomic DNA的PCR是差不多的，所以预变性是要做的。如果只是合成了cDNA的第一条链的话，长度不会特别长，所以模板的复杂性相对下降。至于引物的Tm，和模板的关系更不大了，是要是完全匹配的模板，只和引物的序列有关。计算引物的Tm值有多种方法，结果也稍微有些区别。引物通常是在很大一定的温度范围内都可以扩增，只是对特异性和扩增效率有些不同。最佳的退火温度需要自己实验摸索。
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3楼2013-01-03 06:54:01
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
thinkerboy: 金币+1 2013-01-07 23:34:33
普通PCR的Na+浓度一般是50 mM，参考后者
真实退火温度不止与Na+浓度有关，还和Mg2+浓度、dNTP浓度有关
这个也就是个参考
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4楼2013-01-04 18:19:20
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