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yangjunzju

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR 总是没P出来 已有17人参与

各位虫友,我最近在做PCR,但是我总是没P出来,我的引物有点长,有75个bp,这个东西有影响吗?是不是应该在退火温度和退火时间上要注意一些啊?如果是的话应该如何确定退火温度和时间呢?还请高手指点。。。不胜感激。。。
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lvtd

金虫 (小有名气)

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amisking(金币+1):good! 2010-07-02 18:23:32
yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:23:53
引物太长或太短都有影响。你75个bp,你的延伸温度要多高?不适合酶反应。一般选择15-30个bp,建议你重新设计引物试试。
tobeornottobe,thisisaquestion!
2楼2010-07-02 17:08:13
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yangjunzju

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lvtd at 2010-07-02 17:08:13:
引物太长或太短都有影响。你75个bp,你的延伸温度要多高?不适合酶反应。一般选择15-30个bp,建议你重新设计引物试试。

我的延伸温度是72度,引物不能缩短的情况下有什么办法可以使它尽量P出来吗
3楼2010-07-02 17:30:32
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)


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yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:24:04
建议试试两步法PCR
4楼2010-07-02 17:56:34
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zsxnd

铁杆木虫 (著名写手)


amisking(金币+1):欢迎交流! 2010-07-02 18:23:41
yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:24:09
引物确实长,但是退火温度设定为60左右,然后增加循环数,先低温P几圈,后60多,多批几圈,或者加大点Mg的浓度!
5楼2010-07-02 18:09:22
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ydgua

捐助贵宾 (小有名气)


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yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:24:13
你的目的片段的模板是什么?如果是质粒就应该好做,但如果是cDNA,再加引物这么长,可能会不好做。
6楼2010-07-02 22:30:17
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ydgua

捐助贵宾 (小有名气)

yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:24:18
退火问题你可以根据直接与目的基因配对的那部分序列来推算
7楼2010-07-02 22:31:16
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-07-03 06:24:12
yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:24:25
不管是用软件还是手工设计的引物都不会像lz说的这样长。估计lz的75bp引物其有效引物即与模板配对的部分应该也是15~30bp左右,其余的部分应该在5‘段,作为一段翘起的尾巴。不知是否正确?
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
8楼2010-07-02 23:00:04
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yangjunzju

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-02 23:00:04:
不管是用软件还是手工设计的引物都不会像lz说的这样长。估计lz的75bp引物其有效引物即与模板配对的部分应该也是15~30bp左右,其余的部分应该在5‘段,作为一段翘起的尾巴。不知是否正确?

呵呵,你果然犀利,对的。。。尾巴长有50bp,有效长度为25。。。那么这个退火温度应该怎么确定呢?还请指点,非常感谢。
9楼2010-07-03 12:22:52
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xzx135

铁杆木虫 (正式写手)

一条引物75个bp?太大了吧,这样你的退火温度会很高的。重新设计一下引物,或者分段pcr
10楼2010-07-03 12:33:59
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