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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR 总是没P出来
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yangjunzju

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR 总是没P出来 已有17人参与

各位虫友，我最近在做PCR，但是我总是没P出来，我的引物有点长，有75个bp，这个东西有影响吗？是不是应该在退火温度和退火时间上要注意一些啊？如果是的话应该如何确定退火温度和时间呢？还请高手指点。。。不胜感激。。。
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1楼 2010-07-02 17:02:06
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yangjunzju

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-02 23:00:04:
不管是用软件还是手工设计的引物都不会像lz说的这样长。估计lz的75bp引物其有效引物即与模板配对的部分应该也是15~30bp左右，其余的部分应该在5‘段，作为一段翘起的尾巴。不知是否正确？

呵呵，你果然犀利，对的。。。尾巴长有50bp，有效长度为25。。。那么这个退火温度应该怎么确定呢？还请指点，非常感谢。
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9楼2010-07-03 12:22:52
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lvtd

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):good！ 2010-07-02 18:23:32
yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:23:53
引物太长或太短都有影响。你75个bp，你的延伸温度要多高？不适合酶反应。一般选择15-30个bp，建议你重新设计引物试试。
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tobeornottobe,thisisaquestion!
2楼2010-07-02 17:08:13
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yangjunzju

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lvtd at 2010-07-02 17:08:13:
引物太长或太短都有影响。你75个bp，你的延伸温度要多高？不适合酶反应。一般选择15-30个bp，建议你重新设计引物试试。

我的延伸温度是72度，引物不能缩短的情况下有什么办法可以使它尽量P出来吗
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3楼2010-07-02 17:30:32
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:24:04
建议试试两步法PCR
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4楼2010-07-02 17:56:34
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