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yangjunzju

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR 总是没P出来 已有17人参与

各位虫友,我最近在做PCR,但是我总是没P出来,我的引物有点长,有75个bp,这个东西有影响吗?是不是应该在退火温度和退火时间上要注意一些啊?如果是的话应该如何确定退火温度和时间呢?还请高手指点。。。不胜感激。。。
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yangjunzju

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lvtd at 2010-07-02 17:08:13:
引物太长或太短都有影响。你75个bp,你的延伸温度要多高?不适合酶反应。一般选择15-30个bp,建议你重新设计引物试试。

我的延伸温度是72度,引物不能缩短的情况下有什么办法可以使它尽量P出来吗
3楼2010-07-02 17:30:32
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lvtd

金虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1):good! 2010-07-02 18:23:32
yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:23:53
引物太长或太短都有影响。你75个bp,你的延伸温度要多高?不适合酶反应。一般选择15-30个bp,建议你重新设计引物试试。
tobeornottobe,thisisaquestion!
2楼2010-07-02 17:08:13
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:24:04
建议试试两步法PCR
4楼2010-07-02 17:56:34
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zsxnd

铁杆木虫 (著名写手)


amisking(金币+1):欢迎交流! 2010-07-02 18:23:41
yangjunzju(金币+1): 2010-07-03 12:24:09
引物确实长,但是退火温度设定为60左右,然后增加循环数,先低温P几圈,后60多,多批几圈,或者加大点Mg的浓度!
5楼2010-07-02 18:09:22
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