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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】土壤细菌多样性，引物F357GC R518 PCR老是出问题，求救！
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superadeel

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】土壤细菌多样性，引物F357GC R518 PCR老是出问题，求救！已有6人参与

做土壤细菌多样性时，提的DNA用F357-GC和R518跑PCR ，能扩出来，但是条带很宽，很模糊，后续DGGE切胶，也是P出来很模糊，测序测不出来。

请问哪位大侠做过，经验分享一下，不胜感激。按理来说这个应该很容易做出来，不知道到我这里出了什么问题。

25ul体系：mix  12.5ul, 引物（10UM）各0.5uL，水10.5ul,模板1uL。（用Takara Ex tap 酶体系也做过）

程序：用touchdown，94度6分钟，94度1分钟，65-55度45秒（一循环降0.5度），72度45秒，20循环。后15个循环是94度1分钟，55度45秒，72度45秒。最后延伸10分钟。

[ Last edited by superadeel on 2010-9-28 at 16:58 ]
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1楼2010-09-28 16:56:49
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tsq0126

金虫 (小有名气)
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急切看到回复，我也是遇到相同的问题，哪位做过的仁兄给点建议和意见
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2楼2010-09-28 17:06:31
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superadeel

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by tsq0126 at 2010-09-28 17:06:31:
急切看到回复，我也是遇到相同的问题，哪位做过的仁兄给点建议和意见

你是哪里的？
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3楼2010-09-28 20:20:43
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
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扩增出这样的产物就可以做DGGE了。再试试，DNA多加一些，用2 uL。
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4楼2010-09-29 11:10:30
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superadeel

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2010-09-29 11:10:30:


扩增出这样的产物就可以做DGGE了。再试试，DNA多加一些，用2 uL。

能不能告诉我，你土壤ＤＮＡ是试剂盒提的还是手提，用的ＭＩＸ还是别的什么，程序是怎么样的，大侠希望你帮帮忙，我做了一个多月了，老是跑出来很宽很模糊的条带，不知道你能不能说具体点，　　　关于多加点ＤＮＡ，我试过，效果不是很好！　　期待回复！！
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5楼2010-09-29 12:03:57
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
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土壤DNA采用自己配的试剂提取后采用DNA纯化试剂盒纯化一下就可以了。
PCR MIX扩增的DNA。
程序跟你的差不多也是降落PCR，PCR扩增程序应该没有问题。
依据你的DNA提取的浓度来决定DNA用量吧，如果DNA浓度很高，加1uL也可以，如果浓度低，就加2uL甚至更多。
引用回帖:
Originally posted by superadeel at 2010-09-29 12:03:57:

能不能告诉我，你土壤ＤＮＡ是试剂盒提的还是手提，用的ＭＩＸ还是别的什么，程序是怎么样的，大侠希望你帮帮忙，我做了一个多月了，老是跑出来很宽很模糊的条带，不知道你能不能说具体点，　　　关于多加点ＤＮ ...

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6楼2010-09-30 09:04:14
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
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用touchdown，94度6分钟，94度1分钟，65-55度45秒（一循环降0.5度），72度45秒，20循环。后15个循环是94度1分钟，55度45秒，72度45秒。最后延伸10分钟。
引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2010-09-30 09:04:14:
土壤DNA采用自己配的试剂提取后采用DNA纯化试剂盒纯化一下就可以了。
PCR MIX扩增的DNA。
程序跟你的差不多也是降落PCR，PCR扩增程序应该没有问题。
依据你的DNA提取的浓度来决定DNA用量吧，如果DNA浓度很高， ...

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7楼2010-09-30 09:06:30
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waldenpond

金虫 (著名写手)
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680397楼: Originally posted by superadeel at 2010-09-28 16:56:49
做土壤细菌多样性时，提的DNA用F357-GC和R518跑PCR ，能扩出来，但是条带很宽，很模糊，后续DGGE切胶，也是P出来很模糊，测序测不出来。

请问哪位大侠做过，经验分享一下，不胜感激。按理来说这个应该很容易做出 ...

你是不是也参考的这篇文章？
Yu, Z. and M. Morrison (2004). "Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis." Appl Environ Microbiol 70(8): 4800-4806.
我用touchdown跑出的条带也有问题：条带不够亮而且出现非特异性条带。
不知道还要不要继续用touchdown。
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8楼2012-07-06 17:22:17
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无懈可击萍

铁虫 (初入文坛)
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我也用mix体系扩增，经常出现非特异条带，而且很弱。。。
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9楼2013-06-09 11:22:15
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zhang226296

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by xiadongliang at 2010-09-30 09:04:14
土壤DNA采用自己配的试剂提取后采用DNA纯化试剂盒纯化一下就可以了。
PCR MIX扩增的DNA。
程序跟你的差不多也是降落PCR，PCR扩增程序应该没有问题。
依据你的DNA提取的浓度来决定DNA用量吧，如果DNA浓度很高，加 ...

我也做了一个月了，请教做DGGE必须是现扩先用吗，如果-20储存了几天会有影响吗，我的总是跑不开，是胶浓度有问题还是PCR产物有问题啊，求赐教
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10楼2014-03-18 14:01:23
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