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superadeel

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】土壤细菌多样性，引物F357GC R518 PCR老是出问题，求救！已有6人参与

做土壤细菌多样性时，提的DNA用F357-GC和R518跑PCR ，能扩出来，但是条带很宽，很模糊，后续DGGE切胶，也是P出来很模糊，测序测不出来。

请问哪位大侠做过，经验分享一下，不胜感激。按理来说这个应该很容易做出来，不知道到我这里出了什么问题。

25ul体系：mix 12.5ul, 引物（10UM）各0.5uL，水10.5ul,模板1uL。（用Takara Ex tap 酶体系也做过）

程序：用touchdown，94度6分钟，94度1分钟，65-55度45秒（一循环降0.5度），72度45秒，20循环。后15个循环是94度1分钟，55度45秒，72度45秒。最后延伸10分钟。

[ Last edited by superadeel on 2010-9-28 at 16:58 ]

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1楼 2010-09-28 16:56:49

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zhang226296

新虫 (小有名气)

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引用回帖:

6楼: Originally posted by xiadongliang at 2010-09-30 09:04:14
土壤DNA采用自己配的试剂提取后采用DNA纯化试剂盒纯化一下就可以了。
PCR MIX扩增的DNA。
程序跟你的差不多也是降落PCR，PCR扩增程序应该没有问题。
依据你的DNA提取的浓度来决定DNA用量吧，如果DNA浓度很高，加 ...

我也做了一个月了，请教做DGGE必须是现扩先用吗，如果-20储存了几天会有影响吗，我的总是跑不开，是胶浓度有问题还是PCR产物有问题啊，求赐教