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superadeel新虫 (初入文坛)
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【求助/交流】土壤细菌多样性，引物F357GC R518 PCR老是出问题，求救！ 已有6人参与
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做土壤细菌多样性时，提的DNA用F357-GC和R518跑PCR ，能扩出来，但是条带很宽，很模糊，后续DGGE切胶，也是P出来很模糊，测序测不出来。 请问哪位大侠做过，经验分享一下，不胜感激。按理来说这个应该很容易做出来，不知道到我这里出了什么问题。 25ul体系：mix 12.5ul, 引物（10UM）各0.5uL，水10.5ul,模板1uL。（用Takara Ex tap 酶体系也做过） 程序：用touchdown，94度6分钟，94度1分钟，65-55度45秒（一循环降0.5度），72度45秒，20循环。后15个循环是94度1分钟，55度45秒，72度45秒。最后延伸10分钟。 [ Last edited by superadeel on 2010-9-28 at 16:58 ] |
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 土壤微生物 |
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你是不是也参考的这篇文章？ Yu, Z. and M. Morrison (2004). "Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis." Appl Environ Microbiol 70(8): 4800-4806. 我用touchdown跑出的条带也有问题：条带不够亮而且出现非特异性条带。 不知道还要不要继续用touchdown。 |
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