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superadeel

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】土壤细菌多样性,引物F357GC R518 PCR老是出问题,求救! 已有6人参与

做土壤细菌多样性时,提的DNA用F357-GC和R518跑PCR ,能扩出来,但是条带很宽,很模糊,后续DGGE切胶,也是P出来很模糊,测序测不出来。

请问哪位大侠做过,经验分享一下,不胜感激。按理来说这个应该很容易做出来,不知道到我这里出了什么问题。

25ul体系:mix  12.5ul, 引物(10UM)各0.5uL,水10.5ul,模板1uL。(用Takara Ex tap 酶体系也做过)

程序:用touchdown,94度6分钟,94度1分钟,65-55度45秒(一循环降0.5度),72度45秒,20循环。后15个循环是94度1分钟,55度45秒,72度45秒。最后延伸10分钟。

[ Last edited by superadeel on 2010-9-28 at 16:58 ]
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superadeel

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2010-09-29 11:10:30:


扩增出这样的产物就可以做DGGE了。再试试,DNA多加一些,用2 uL。

能不能告诉我,你土壤DNA是试剂盒提的还是手提,用的MIX还是别的什么,程序是怎么样的,大侠希望你帮帮忙,我做了一个多月了,老是跑出来很宽很模糊的条带,不知道你能不能说具体点,   关于多加点DNA,我试过,效果不是很好!  期待回复!!
5楼2010-09-29 12:03:57
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tsq0126

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
急切看到回复,我也是遇到相同的问题,哪位做过的仁兄给点建议和意见
2楼2010-09-28 17:06:31
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superadeel

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by tsq0126 at 2010-09-28 17:06:31:
急切看到回复,我也是遇到相同的问题,哪位做过的仁兄给点建议和意见

你是哪里的?
3楼2010-09-28 20:20:43
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xiadongliang

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流


扩增出这样的产物就可以做DGGE了。再试试,DNA多加一些,用2 uL。
4楼2010-09-29 11:10:30
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