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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】土壤细菌多样性，引物F357GC R518 PCR老是出问题，求救！
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superadeel

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】土壤细菌多样性，引物F357GC R518 PCR老是出问题，求救！已有6人参与

做土壤细菌多样性时，提的DNA用F357-GC和R518跑PCR ，能扩出来，但是条带很宽，很模糊，后续DGGE切胶，也是P出来很模糊，测序测不出来。

请问哪位大侠做过，经验分享一下，不胜感激。按理来说这个应该很容易做出来，不知道到我这里出了什么问题。

25ul体系：mix  12.5ul, 引物（10UM）各0.5uL，水10.5ul,模板1uL。（用Takara Ex tap 酶体系也做过）

程序：用touchdown，94度6分钟，94度1分钟，65-55度45秒（一循环降0.5度），72度45秒，20循环。后15个循环是94度1分钟，55度45秒，72度45秒。最后延伸10分钟。

[ Last edited by superadeel on 2010-9-28 at 16:58 ]
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1楼2010-09-28 16:56:49
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waldenpond

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
680397楼: Originally posted by superadeel at 2010-09-28 16:56:49
做土壤细菌多样性时，提的DNA用F357-GC和R518跑PCR ，能扩出来，但是条带很宽，很模糊，后续DGGE切胶，也是P出来很模糊，测序测不出来。

请问哪位大侠做过，经验分享一下，不胜感激。按理来说这个应该很容易做出 ...

你是不是也参考的这篇文章？
Yu, Z. and M. Morrison (2004). "Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis." Appl Environ Microbiol 70(8): 4800-4806.
我用touchdown跑出的条带也有问题：条带不够亮而且出现非特异性条带。
不知道还要不要继续用touchdown。
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8楼2012-07-06 17:22:17
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tsq0126

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
急切看到回复，我也是遇到相同的问题，哪位做过的仁兄给点建议和意见
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2楼2010-09-28 17:06:31
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superadeel

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by tsq0126 at 2010-09-28 17:06:31:
急切看到回复，我也是遇到相同的问题，哪位做过的仁兄给点建议和意见

你是哪里的？
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3楼2010-09-28 20:20:43
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流


扩增出这样的产物就可以做DGGE了。再试试，DNA多加一些，用2 uL。
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4楼2010-09-29 11:10:30
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