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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR 总是没P出来
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-03 14:34:30
scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-07-03 20:27:31
首先引物大约是20碱基左右，你先调低退火温度看看有没有特异性条带出来，如果这个都没有那就要重新做CDNA薄板了，这个也很重要！
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11楼2010-07-03 14:26:41
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木木803

金虫 (正式写手)
★ ★
yangjunzju(金币+1):倒是有这个可能性，没考虑这一点~~ 2010-07-03 15:02:49
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-03 20:27:39
引物有没有不利于退火的自身二级结构？我的意思是这么长的primer也许存在较长的stem，退火温度时打不开，就没法延伸了，呵呵

[ Last edited by 木木803 on 2010-7-3 at 14:39 ]
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12楼2010-07-03 14:38:23
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-03 20:27:45
试下touch down 吧
看有用不
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13楼2010-07-03 15:19:56
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-07-03 20:27:58
yangjunzju(金币+2):呵呵，非常感谢，以后有关实验的东西还得请教下你哈！ 2010-07-05 16:24:16
引用回帖:
Originally posted by yangjunzju at 2010-07-03 12:22:52:


呵呵，你果然犀利，对的。。。尾巴长有50bp，有效长度为25。。。那么这个退火温度应该怎么确定呢？还请指点，非常感谢。

呵呵~我做过一步缺失中60bp和70bp引物的扩增，其中有效长度20bp。建议你分析一下PCR反应中参与配对的25bp Tm值，以此为参照，适当降低2~5度作为反应中的退火温度，应该能扩出来。

另外，如果是想做3-step PCR，5‘端的尾巴就没必要那么长，可适当缩短。据我所知，59bp和60bp的引物合成收费差别很大，呵呵~祝实验顺利！
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
14楼2010-07-03 16:34:55
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kangshaofeng

新虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-03 20:28:05
这样的话你可以适当去调整退火温度和时间，一般如果有引物二聚体的话建议将退火温度降低1-2度，再p。
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15楼2010-07-03 17:00:58
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kangshaofeng

新虫 (小有名气)
这样的话你可以适当去调整退火温度和时间，一般如果有引物二聚体的话建议将退火温度降低1-2度，再p。
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16楼2010-07-03 17:02:24
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627455987

木虫 (小有名气)
引物大了，也可用温度梯度筛选
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17楼2010-07-04 00:19:37
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
看天(金币+3):新虫鼓励 2010-07-04 10:42:46
用两步PCR做，第一步用Tm值算退火温度，第二步退火温度和延伸温度一致试试！
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18楼2010-07-04 10:08:18
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308145157

木虫 (著名写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-06 00:20:51
可以试一下PCR先做5~10个循环的三步法（退火温度根据配对部分计算），接着用两步法（退火和延伸用一个温度）。
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心若在，梦就在......
19楼2010-07-05 16:05:43
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-06 00:20:56
貌似看到过这样的方法：引物混合后加热变性，然后快速冷却，保持4度，PCR加反应体系时加入就可以防止引物聚合的问题
不知好使不~~楼主可以试试~~
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但愿快乐不停歇，悲伤不再来~
20楼2010-07-05 23:07:01
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