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yangjunzju

木虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】PCR 总是没P出来已有17人参与

各位虫友，我最近在做PCR，但是我总是没P出来，我的引物有点长，有75个bp，这个东西有影响吗？是不是应该在退火温度和退火时间上要注意一些啊？如果是的话应该如何确定退火温度和时间呢？还请高手指点。。。不胜感激。。。

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1楼2010-07-02 17:02:06

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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

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专业: 病原细菌、细菌感染与宿主

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scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-07-03 20:27:58
yangjunzju(金币+2):呵呵，非常感谢，以后有关实验的东西还得请教下你哈！ 2010-07-05 16:24:16

引用回帖:

Originally posted by yangjunzju at 2010-07-03 12:22:52:

呵呵，你果然犀利，对的。。。尾巴长有50bp，有效长度为25。。。那么这个退火温度应该怎么确定呢？还请指点，非常感谢。

呵呵~我做过一步缺失中60bp和70bp引物的扩增，其中有效长度20bp。建议你分析一下PCR反应中参与配对的25bp Tm值，以此为参照，适当降低2~5度作为反应中的退火温度，应该能扩出来。

另外，如果是想做3-step PCR，5‘端的尾巴就没必要那么长，可适当缩短。据我所知，59bp和60bp的引物合成收费差别很大，呵呵~祝实验顺利！