应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SSR引物退火温度如何确定，求助！
101/1返回列表
查看: 2977  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

ljw0931

金虫 (小有名气)

[交流] SSR引物退火温度如何确定，求助！

1、PCR反应体系：
Template DNA （50ng/ul） 1ul
Taq                                      0.2ul
dNTPs                                  2ul
10 Buffer                              2ul
Primer F                               1ul
          R                               1ul
ddH2O                                 12.8ul
2、梯度PCR     grade 46/58度
3、图片是两个样品DNA、3对引物在梯度PCR下的扩增。其中，第一排从左向右，紧接着第二排从左向右，中间是Marker DL 2000，分别用蓝、绿、粉表示不同的3对引物在8个温度梯度下的扩增效果。

问题：
1、请问这3对引物的最佳退火温度是多少？
2、3对引物中那一对扩增多态性更好？
3、有什么需要改进的地方？
谢谢！

YINWU001001.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-08-30 22:52:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
ljw0931(金币+1): 谢谢参与
1949stone: 金币+3, 如果是荧光标记检测 问题就不大 如果不是 您的建议很中肯 2012-08-31 07:18:49
1，个人感觉你的引物浓度偏高了，因为几乎所有反应都有引物二聚体，请减少引物用量。
2，第二对引物请减少上样量，因为那条带是引物二聚体还是扩增产物，比较第2对和第三对引物似乎又像是扩增产物。。。
3，第一对引物，48度就不错。第二对引物，不好说。第三对引物，请提高一点退火温度再看，虽然带纹不少，但是感觉非特异的应该居多。
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-31 07:09:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ZOEY21

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
ljw0931(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-01 15:37:14
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 07:09:47
1，个人感觉你的引物浓度偏高了，因为几乎所有反应都有引物二聚体，请减少引物用量。
2，第二对引物请减少上样量，因为那条带是引物二聚体还是扩增产物，比较第2对和第三对引物似乎又像是扩增产物。。。
3，第一对 ...

我以为SSR产物一般在100~300bp间有单一条带。你在扩增前应该大概知道产物大小，比对marker就知道是否引物二聚体。从图上看，粉色引物在58度下特异性好一些，杂带较少，可以在适当提高退火温度。第二对引物我觉得像扩增产物，高退火挺好。第一对不知是条件不对还是引物不好，都有二聚体。
如果SSR检测多态性琼脂糖不太可能吧，可以荧光标记或者跑聚丙烯酰胺凝胶电泳。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-08-31 08:59:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

wu_shiyong

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-09-01 15:37:23
引物加一半就好啦！
其实SSR去追求最适退火温度意义不是很大，我做过很多SSR，一般温度都是56度用，只有在有的特异性非常不好的引物才提高温度，这样感觉才明显，大多引物提高退火温度差异并不明显！
还有不知你的群体多大，而且SSR相对片段较小，建议你别跑琼脂糖的胶用PAGE。你是怎么读带的？如果你群体很大特异引物也比较多，琼脂糖会很累的！用荧光标记的话多态性不好的引物分析数据时得人为的去掉非特异的带，而且数据不直观，用PAGE统计时是很直观的，是否是特异条带很好看出，这样统计过后可以直接输入电脑用软件分析，荧光的话你还得一个一个看！而且有的引物特异条带并非是主带而是附带，当然你的物种是2倍体的话这种情况会很少的！
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-08-31 09:15:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-01 15:37:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by ZOEY21 at 2012-08-31 08:59:08
我以为SSR产物一般在100~300bp间有单一条带。你在扩增前应该大概知道产物大小，比对marker就知道是否引物二聚体。从图上看，粉色引物在58度下特异性好一些，杂带较少，可以在适当提高退火温度。第二对引物我觉得像 ...

SSR一般在100-300是没错的，但是物种不同，分子量也不尽相同，我做的物种很多都是在80左右的。如果低于100很难说明到底是引物二具体还是扩增产物。
其次，如果没有开发SSR引物的物种用其他物种的引物来做，是不知道具体产物大小的。此外，琼脂糖可以用来检测，只是灵敏度低而已。
丙烯酰胺胶是个好建议，但是要看具体差异大小占扩增片段的比例，例如我做过80bp左右的，两个物种差1个bp，可以分开。但是产物300bp，差3个bp就无法分辨。因而，用荧光标记用测序仪来做时最好的选择。
赞一下 回复此楼
5楼2012-08-31 09:47:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ZOEY21

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 09:47:36
SSR一般在100-300是没错的，但是物种不同，分子量也不尽相同，我做的物种很多都是在80左右的。如果低于100很难说明到底是引物二具体还是扩增产物。
其次，如果没有开发SSR引物的物种用其他物种的引物来做，是不知 ...

多谢！借楼主的帖子受教了！具体问题具体分析，大意大意了...
赞一下 回复此楼
6楼2012-08-31 12:28:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ljw0931

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 09:47:36
SSR一般在100-300是没错的，但是物种不同，分子量也不尽相同，我做的物种很多都是在80左右的。如果低于100很难说明到底是引物二具体还是扩增产物。
其次，如果没有开发SSR引物的物种用其他物种的引物来做，是不知 ...

谢谢，请问用荧光标记效果怎么样，哪里有相关参考资料！
赞一下 回复此楼
7楼2012-08-31 12:54:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by ljw0931 at 2012-08-31 12:54:17
谢谢，请问用荧光标记效果怎么样，哪里有相关参考资料！...

这个一般用测序仪来做，我没见相关参考资料，如果你们有测序仪可以看下它的说明书。或者网上你可以索索一下是否有相关资料。
赞一下 回复此楼
8楼2012-08-31 14:37:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ljw0931

金虫 (小有名气)
将引物浓度减半后，结果是一样的，除了类似二聚体的产物外，没有其他扩增产物！
赞一下 回复此楼
9楼2012-08-31 21:49:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wu_shiyong

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by ljw0931 at 2012-08-31 21:49:56
将引物浓度减半后，结果是一样的，除了类似二聚体的产物外，没有其他扩增产物！

引物减少只能让引物二聚体减少或者消失，不会有别的效果的。
赞一下 回复此楼
10楼2012-09-03 10:53:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ljw0931 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +55 医学老男孩 2026-08-13 123/6150 2026-08-19 23:44 by stan_et
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +13 kkkl_v 2026-08-19 13/650 2026-08-19 22:37 by 宝贝虫子
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +12 基诺咪客 2026-08-17 16/800 2026-08-19 22:04 by kk 的小木虫
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +10 yuleib84 2026-08-18 11/550 2026-08-19 07:30 by 羽毛枫f
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭