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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR的若干问题
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cherry5323

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PCR的若干问题 已有7人参与

PCR的退火温度怎么决定啊？在知道一对引物的各自TM值的情况下，怎么确定退火温度？
扩增1665bp和1445bp的条带，有没什么特殊的要求？
两对引物一起做，一个引物各做8个温度梯度，为什么一个引物都扩出来了，一个引物都没有扩出来？
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1楼 2010-10-30 14:09:04
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超然渡陈之家

新虫 (初入文坛)
★
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“为什么一个引物都扩出来了，一个引物都没有扩出来”这句话什么意思？
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2楼2010-10-30 15:29:11
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aaron2012

银虫 (初入文坛)
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dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-01 10:14:03
延伸时间你是多少啊   然后你设置的温度梯度是多少啊   一般是给的TM值减去5到10，我建议你试一下55度     我也遇到和你一样的情况   55 就做出来了   另外你看是不是加样的时候出现问题了  多做几次
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生物，特别是分子生物，贵在坚持！
3楼2010-11-01 09:50:32
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-01 10:14:10
那么短的片段。怎么都能扩出来的。   扩不出来考虑其他因素 比如引物设计 比如样品。   
这样的东西最好重复几次。 别一次没出来就问。 很多偶然因素 你并不知道的。
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4楼2010-11-01 09:55:24
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amilie030312

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-01 10:14:18
出和不出影响因素很多，要看退火温度对不对，一般的退火温度是TM值减5左右，如果做梯度都没做出来首先可能是你温度范围选择的不对，其次是否是完全按照说明书去做的，再有模板是否GC含量很高，这些都有影响。
呵呵，最后也可能所有问题都想到了还不出，那就换引物吧，片段1K多不算长
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5楼2010-11-01 09:56:25
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xj871008

铁杆木虫 (著名写手)

升斗小民
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-01 10:14:25
退火温度越低，条带越多。引物上应该都写退火温度吧，根据引物上写的退火温度再低四五度，应该可以吧。我毕设就是这么做的。
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6楼2010-11-01 10:02:23
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爱莫若月

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
退火温度应该是按照引物上的TM值吧，两个不一样的时候就按低的那个
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7楼2010-11-01 10:52:04
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hjyxm

木虫 (正式写手)
★
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正在学习这方面的，希望有更多人来解决这些问题啊！
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好好工作！
8楼2010-11-03 15:34:50
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