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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR求助
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zhtongshi

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR求助

pcr实验
    做总DNA的PCR时，第一次能成功的做出来，而且做得非常好，但接下来再怎么做都失败。非常着急，请高人指点！
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1楼 2010-09-23 10:07:00
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qiangfeng

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5):欢迎分享经验！ 2010-09-23 19:02:22
zhtongshi(金币+1): 2010-09-28 09:26:24
我认为原因主要有两个：
1. 你第一次成功可能是总DNA提取后就立即做PCR，这时总DNA是完整的，
总DNA放一段时间后，总DNA已降解或受到损伤，使目的基因无法获得
2. 可能是你做PCR时用到的试剂出问题了，可以换用新试剂试试
另外，再问一下，你是用什么试剂提取的总DNA？
PCR时，都用的哪些公司的试剂？
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顺势而行，问心无愧！
2楼2010-09-23 10:31:09
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
提取DNA后最好在4度放置，以避免反复冻融引起DNA降解。
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3楼2010-09-23 13:44:11
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
zhtongshi(金币+1): 2010-09-28 09:26:34
所双蒸水，枪头，灭菌再用，可能你的加样有问题吧！ DNA没问题，下游试验就考虑引物，酶，dNTPS等
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4楼2010-09-23 16:49:40
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green1223
引用回帖:
Originally posted by cxb-abc at 2010-09-23 16:49:40:
所双蒸水，枪头，灭菌再用，可能你的加样有问题吧！ DNA没问题，下游试验就考虑引物，酶，dNTPS等

支持你
5楼2010-09-23 17:15:04
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小小豆豆

金虫 (小有名气)
楼上分析的有道理，呵呵
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6楼2010-09-23 20:34:01
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rosalie161

金虫 (正式写手)
我也是最近做的，遇到了相同的问题，都优化了一个月了。最后，发现是循环太多了，可以减少到30个以内试试。
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Rosalei.....
7楼2010-09-24 08:43:52
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zhtongshi

铜虫 (小有名气)

问题补充

我从新定的引物还是遇到相同的问题，如果因为没有灭菌，或DNA污染，那应该做不出来。
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8楼2010-09-24 08:55:10
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zhtongshi

铜虫 (小有名气)

问题补充

PCR体系没问题，要么是引物要么是总
DNA，各位大侠帮忙分析一下这两项
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9楼2010-09-24 09:31:22
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)
如果引物跟第一次成功时用的引物是一样的，引物就应该没问题，可能是总DNA的问题，时间长了，或者反复冻融可能会对DNA造成损伤
我是这么想的，仅供参考，我也是刚开始接触这方面
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10楼2010-09-24 10:54:20
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