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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR
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guanjinke

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR 已有7人参与

各位师兄师姐：PCR扩出来产物的亮度不高。求教这个问题怎么解决？谢谢！
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1楼 2011-03-08 16:35:08
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
调整退火温度。
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2楼2011-03-08 16:38:54
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guanjinke

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-03-08 16:38:54:
调整退火温度。

谢谢！
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3楼2011-03-08 16:48:05
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guanjinke

银虫 (小有名气)
那用不用换引物？
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4楼2011-03-08 16:49:17
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-03-08 20:11:27
原因分析
1：你跑胶点的太少了，
2：最好先设置一个pcr温度梯度，看看哪一个温度下p出来的最亮，那么大批量进行扩增的时候就用这个温度！
赞一下(2人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-03-08 17:06:54
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guanjinke

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-03-08 17:06:54:
原因分析
1：你跑胶点的太少了，
2：最好先设置一个pcr温度梯度，看看哪一个温度下p出来的最亮，那么大批量进行扩增的时候就用这个温度！

谢谢！我试一下。
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6楼2011-03-08 17:14:03
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
以第一次的扩展产物再扩展一次
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风雪夜归人
7楼2011-03-08 17:20:48
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yj-lzx

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫生化熊

优秀版主
模板试着多加点~~~
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曾经的你/以为只要带着那把青春的长剑和赤子的良心就可以说服自己不出卖理想的灵魂/在最寂寞和不得不流泪的晚上/即使连自己都在笑自己傻/依然拔出怀中的长剑~~~
8楼2011-03-08 17:24:05
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yunbfly

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主说得太模糊。
不亮一般是产物浓度低，浓度低缘于PCR效率低，或者是循环数太少。影响效率的因素就很多了，常见的是温度、Mg离子浓度、dNTP浓度、taq酶活性等。但我们一般只调整退火温度。退火温度不是越低产物浓度越高，我们曾遇到过低了也不亮的情况，这可能是因为引物有二聚体或者发卡结构，温度低了会降低有效的引物浓度。最后一个最重要的因素就是引物，有些引物随便就能扩出来，有些引物做一个月只能扩出一两次（这种引物很刁钻，如果不是必须用它，就另外设计再做，有时候移动几个碱基就非常好扩了）。
如果是碰到刁钻的引物，扩了很久扩不好，试着调整一下退火时间和延伸时间。我曾有对刁钻引物扩了快一个月，总是偶尔能扩出，后来一怒之下，将退火时间从1min改成45s，成了！还有师弟做另一对引物，延长延伸时间30s，带就浓了。
PCR是个折磨人的事，慢慢享受吧！还有，别迷信primer premier给出的引物分数，有时候那完全是浮云。

[ Last edited by yunbfly on 2011-3-8 at 17:44 ]
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9楼2011-03-08 17:39:43
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guanjinke

银虫 (小有名气)
谢谢各位！我再试一下。
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10楼2011-03-08 17:52:02
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