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guanjinke银虫 (小有名气)
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【求助/交流】PCR 已有7人参与
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各位师兄师姐：PCR扩出来产物的亮度不高。求教这个问题怎么解决？谢谢！  |
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lxj341401
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2楼2011-03-08 16:38:54
guanjinke
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6楼2011-03-08 17:14:03
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7楼2011-03-08 17:20:48
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8楼2011-03-08 17:24:05
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楼主说得太模糊。 不亮一般是产物浓度低，浓度低缘于PCR效率低，或者是循环数太少。影响效率的因素就很多了，常见的是温度、Mg离子浓度、dNTP浓度、taq酶活性等。但我们一般只调整退火温度。退火温度不是越低产物浓度越高，我们曾遇到过低了也不亮的情况，这可能是因为引物有二聚体或者发卡结构，温度低了会降低有效的引物浓度。最后一个最重要的因素就是引物，有些引物随便就能扩出来，有些引物做一个月只能扩出一两次（这种引物很刁钻，如果不是必须用它，就另外设计再做，有时候移动几个碱基就非常好扩了）。 如果是碰到刁钻的引物，扩了很久扩不好，试着调整一下退火时间和延伸时间。我曾有对刁钻引物扩了快一个月，总是偶尔能扩出，后来一怒之下，将退火时间从1min改成45s，成了！还有师弟做另一对引物，延长延伸时间30s，带就浓了。 PCR是个折磨人的事，慢慢享受吧！还有，别迷信primer premier给出的引物分数，有时候那完全是浮云。 [ Last edited by yunbfly on 2011-3-8 at 17:44 ] |
9楼2011-03-08 17:39:43
guanjinke
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10楼2011-03-08 17:52:02
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