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ljw0931

金虫 (小有名气)

[交流] SSR引物退火温度如何确定，求助！

1、PCR反应体系：
Template DNA （50ng/ul） 1ul
Taq                                      0.2ul
dNTPs                                  2ul
10 Buffer                              2ul
Primer F                               1ul
          R                               1ul
ddH2O                                 12.8ul
2、梯度PCR     grade 46/58度
3、图片是两个样品DNA、3对引物在梯度PCR下的扩增。其中，第一排从左向右，紧接着第二排从左向右，中间是Marker DL 2000，分别用蓝、绿、粉表示不同的3对引物在8个温度梯度下的扩增效果。

问题：
1、请问这3对引物的最佳退火温度是多少？
2、3对引物中那一对扩增多态性更好？
3、有什么需要改进的地方？
谢谢！

YINWU001001.JPG
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1楼2012-08-30 22:52:08
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-09-01 15:37:23
引物加一半就好啦！
其实SSR去追求最适退火温度意义不是很大，我做过很多SSR，一般温度都是56度用，只有在有的特异性非常不好的引物才提高温度，这样感觉才明显，大多引物提高退火温度差异并不明显！
还有不知你的群体多大，而且SSR相对片段较小，建议你别跑琼脂糖的胶用PAGE。你是怎么读带的？如果你群体很大特异引物也比较多，琼脂糖会很累的！用荧光标记的话多态性不好的引物分析数据时得人为的去掉非特异的带，而且数据不直观，用PAGE统计时是很直观的，是否是特异条带很好看出，这样统计过后可以直接输入电脑用软件分析，荧光的话你还得一个一个看！而且有的引物特异条带并非是主带而是附带，当然你的物种是2倍体的话这种情况会很少的！
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4楼2012-08-31 09:15:27
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
ljw0931(金币+1): 谢谢参与
1949stone: 金币+3, 如果是荧光标记检测 问题就不大 如果不是 您的建议很中肯 2012-08-31 07:18:49
1，个人感觉你的引物浓度偏高了，因为几乎所有反应都有引物二聚体，请减少引物用量。
2，第二对引物请减少上样量，因为那条带是引物二聚体还是扩增产物，比较第2对和第三对引物似乎又像是扩增产物。。。
3，第一对引物，48度就不错。第二对引物，不好说。第三对引物，请提高一点退火温度再看，虽然带纹不少，但是感觉非特异的应该居多。
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2楼2012-08-31 07:09:47
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
ljw0931(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-01 15:37:14
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 07:09:47
1，个人感觉你的引物浓度偏高了，因为几乎所有反应都有引物二聚体，请减少引物用量。
2，第二对引物请减少上样量，因为那条带是引物二聚体还是扩增产物，比较第2对和第三对引物似乎又像是扩增产物。。。
3，第一对 ...

我以为SSR产物一般在100~300bp间有单一条带。你在扩增前应该大概知道产物大小，比对marker就知道是否引物二聚体。从图上看，粉色引物在58度下特异性好一些，杂带较少，可以在适当提高退火温度。第二对引物我觉得像扩增产物，高退火挺好。第一对不知是条件不对还是引物不好，都有二聚体。
如果SSR检测多态性琼脂糖不太可能吧，可以荧光标记或者跑聚丙烯酰胺凝胶电泳。
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3楼2012-08-31 08:59:08
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-01 15:37:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by ZOEY21 at 2012-08-31 08:59:08
我以为SSR产物一般在100~300bp间有单一条带。你在扩增前应该大概知道产物大小，比对marker就知道是否引物二聚体。从图上看，粉色引物在58度下特异性好一些，杂带较少，可以在适当提高退火温度。第二对引物我觉得像 ...

SSR一般在100-300是没错的，但是物种不同，分子量也不尽相同，我做的物种很多都是在80左右的。如果低于100很难说明到底是引物二具体还是扩增产物。
其次，如果没有开发SSR引物的物种用其他物种的引物来做，是不知道具体产物大小的。此外，琼脂糖可以用来检测，只是灵敏度低而已。
丙烯酰胺胶是个好建议，但是要看具体差异大小占扩增片段的比例，例如我做过80bp左右的，两个物种差1个bp，可以分开。但是产物300bp，差3个bp就无法分辨。因而，用荧光标记用测序仪来做时最好的选择。
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5楼2012-08-31 09:47:36
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