24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 3613  |  回复: 5

thinkerboy

铁虫 (小有名气)

[求助] 怎么确定变性和退火温度

我反转录成cDNA第一链后,以cDNA第一链为模板进行PCR反应,该怎么设置循环条件,需要94℃预变性么退火温度怎么确定,我用的是invitrogen合成的引物,它给了两个退火温度,一个是1M Na+ 的TM为66.5和67.9值,另一个是50mM Na+的TM为44.9和46.3值,这该怎么确定他的退火温度。

[ Last edited by thinkerboy on 2013-1-2 at 22:54 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
变性温度根据酶来定
一般的酶94度95度都可以 有的比如Phusion要98度 看说明书
退火温度看引物
一般退火温度是Tm-5度 因为Tm计算方法不同有时也不必太在意 普通长度的PCR引物退火温度在55到65度之间 上手不愿意做退火温度梯度的话可以先用55度扩 有杂带的话再提高
2楼2013-01-02 23:26:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
以cDNA为模板的PCR和普通用genomic DNA的PCR是差不多的,所以预变性是要做的。如果只是合成了cDNA的第一条链的话,长度不会特别长,所以模板的复杂性相对下降。至于引物的Tm,和模板的关系更不大了,是要是完全匹配的模板,只和引物的序列有关。计算引物的Tm值有多种方法,结果也稍微有些区别。引物通常是在很大一定的温度范围内都可以扩增,只是对特异性和扩增效率有些不同。最佳的退火温度需要自己实验摸索。
3楼2013-01-03 06:54:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
thinkerboy: 金币+1 2013-01-07 23:34:33
普通PCR的Na+浓度一般是50 mM,参考后者
真实退火温度不止与Na+浓度有关,还和Mg2+浓度、dNTP浓度有关
这个也就是个参考
4楼2013-01-04 18:19:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hdzhonghai

铁虫 (初入文坛)

刚开始做PCR,才学着看资料。

想问一下qPCR的反应温度是参考别人的反应条件还是参考试剂的说明,用的是ABI的SYBR。谢谢!
5楼2016-06-09 20:59:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yaohuaibing

铁杆木虫 (著名写手)

pcr条件根据你用的酶,taq酶94或95  star96 ,一般30循环。退火文都一般不考虑引物的文都 56-58都可以试试,如果有杂带,建议提高退火温度即可
每天都在读书和读人。书易懂,人难解。
6楼2016-06-09 23:08:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 thinkerboy 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿北化085600材料专硕275|有文章专利|求调剂 +10 Micky11223 2026-03-25 10/500 2026-03-31 00:18 by jp9609
[考研] 一志愿 南京航空航天大学 ,080500材料科学与工程学硕 +3 @taotao 2026-03-30 3/150 2026-03-31 00:13 by jp9609
[考研] 理学07化学 303求调剂 +4 睿08 2026-03-27 4/200 2026-03-30 23:29 by yujianx
[有机交流] 甲基亚磺磺酸钠和甲基磺酸酯反应机理 10+3 kaobao456 2026-03-29 4/200 2026-03-30 23:16 by nBu锂
[考研] 083000环境科学与工程调剂,总分281 +3 橙子(胜意) 2026-03-30 3/150 2026-03-30 20:07 by piklet
[考研] 085601材料工程找调剂 +17 oatmealR 2026-03-29 18/900 2026-03-30 19:21 by Wang200018
[考研] 287求调剂 +14 land xuxu 2026-03-26 14/700 2026-03-30 18:38 by 544594351
[考研] 324求调剂 +9 hanamiko 2026-03-26 11/550 2026-03-30 14:27 by JourneyLucky
[考研] 环境科学与工程334分求调剂 +6 王一一依依 2026-03-30 8/400 2026-03-30 11:52 by yjolah
[考研] 282求调剂 +4 wcq131415 2026-03-24 4/200 2026-03-30 10:39 by Delta2012
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +4 邱gl 2026-03-26 7/350 2026-03-30 08:39 by 探123
[考研] 311(085601)求调剂 +4 liziyeyeye 2026-03-28 4/200 2026-03-28 18:50 by 535743368
[考研] 320分,材料与化工专业,求调剂 +9 一定上岸aaa 2026-03-27 13/650 2026-03-28 15:00 by 神马都不懂
[考研] 352分 化工与材料 +5 海纳百川Ly 2026-03-27 5/250 2026-03-28 03:39 by fmesaito
[考研] 复试调剂,一志愿南农083200食品科学与工程 +5 XQTJZ 2026-03-26 5/250 2026-03-27 14:49 by 狂炫麦当当
[考研] 一志愿吉大071010,316分求调剂 +3 xgbiknn 2026-03-27 3/150 2026-03-27 10:36 by guoweigw
[考研] 324求调剂 +5 hanamiko 2026-03-26 5/250 2026-03-27 10:33 by wangjy2002
[考研] 085602化学工程求调剂。 +4 平乐乐乐 2026-03-26 4/200 2026-03-26 17:57 by fmesaito
[考研] 网络空间安全0839招调剂 +4 w320357296 2026-03-25 6/300 2026-03-25 17:59 by 255671
[考研] 293求调剂 +7 加一一九 2026-03-24 7/350 2026-03-25 12:02 by userper
信息提示
请填处理意见