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小虎6487

金虫 (小有名气)

[求助] PCR引物退火温度怎么计算?

最近做PCR设计了一对引物,引物序列为:
F:CGTGCCTCCTATCCACGATTCCG
R:ATTTTGCGTAATTGGGTTTGATT
  引物序列和模版完全配对的,可是实验的时候成功率很低,每次都只能扩增出来不多几个样本,引物合成报告单上正向引物的Tm值65.5度,反向引物53度,是不是因为两条引物的Tm值相差太大啊?已经尝试了好几个温度了还是扩增效率很低?
  求高手帮忙分析哪里出问题了,需要重新设计引物吗,有个同学说可以给反向引物的5'端增加几个碱基提高一下退火温度,这样做可以吗?每条引物的退火温度怎样单独计算啊?
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适者生存
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amareyue

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你可以在两者之间设多个温度梯度自己摸索一下最适合的温度,如果有温度非特异扩增不明显,就这个温度扩增然后切胶回收自己需要的带,如果都不怎么样,非特异扩增较明显的话,就重新设计引物吧
4楼2013-08-11 16:30:15
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