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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 退火温度的优化
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ann花开花落

铜虫 (正式写手)

[求助] 退火温度的优化

退火温度的优化，看到书上说比Tm低2-10℃的范围内，由高到低的设定同一反应体系中连续的不同循环的退火温度，可以避免同时做多个平行试验的繁琐操作，这个我没懂，能不能帮忙解释下呢
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1楼 2013-02-28 16:09:02
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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amisking: 回帖置顶 2013-02-28 19:02:09
ann花开花落: 金币+3, ★★★很有帮助, 懂了 2013-03-01 11:24:06
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-04-10 17:46:19
楼上说的都对，举例来说：你的引物计算Tm值为58度，在支持Touchdown PCR的PCR仪里可以设定第一个循环的退火温度为68（比计算值高10度），第二个为66.第三个为64....每个循环的退火温度比前一个低1~2度，直到降到58度，并以58度继续进行PCR剩余的循环数。这样可以极大的减少非特异性的扩增。
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4楼2013-02-28 18:25:04
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普通回帖

lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-02-28 19:02:01
ann花开花落: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-01 11:24:20
这个就是降落PCR，不同于梯度PCR，降落是在一个PCR管子里体系经历不同的退火温度，梯度是每一个管子有一个退火温度！降落比较省事，但你不知道哪个是最佳退火温度，梯度可以知道！
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寻找真正的自我！
2楼2013-02-28 16:18:32
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2013-02-28 19:02:06
ann花开花落: 金币+2, ★有帮助 2013-03-01 11:24:32
梯度PCR是设置平行的几个（仪器一般是十二个）退火温度，每个系列都按照此系列的退火温度同时进行PCR反应，目的在于摸索退火温度
touchdown PCR是指设置一个最高退火温度，然后PCR每进行一个反应后减低n度后再进行下一个PCR反应，目的在于提高特异性PCR产物，减少非特异性扩增
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生物化学与分子生物学
3楼2013-02-28 16:34:40
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a_biao

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人认为应该是：计算的Tm值附近进行梯度PCR；然后摸索出较优化的退火温度后，再对该样本采取降落PCR扩增来减少非特异扩增的产物。
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5楼2013-03-02 21:02:45
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莹彬2012

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mascotte at 2013-02-28 18:25:04
楼上说的都对，举例来说：你的引物计算Tm值为58度，在支持Touchdown PCR的PCR仪里可以设定第一个循环的退火温度为68（比计算值高10度），第二个为66.第三个为64....每个循环的退火温度比前一个低1~2度，直到降到58度 ...

谢谢moscotte 啦，我最近也在用touch down程序扩增，就是不太确定程序第一个循环的退火温度？是引物计算的Tm值还是比它高10℃？O(∩_∩)O谢谢
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6楼2013-04-09 17:19:47
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我一般是前5个循环做touchdown， 第一个循环比引物的TM高10度，第二个高8度，。。。第六个循环至第30个循环按照引物的Tm进行退火
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7楼2013-04-09 21:21:01
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