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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】PCR退火温度及时间如何确定
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痴书小孩

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 【求助】PCR退火温度及时间如何确定已有9人参与

我是新人，还不懂，是不是跟引物Tm有关，如何算呢，还有就是PCR每步的时间怎么算的，望大家指点

[ Last edited by amisking on 2010-8-25 at 20:42 ]
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1楼2010-08-25 10:49:21
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霍123

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):欢迎分享经验 2010-08-25 20:42:07
amisking(金币+5):新虫鼓励！ 2010-08-25 20:42:18
最好的方法就是自己设个温度梯度P一下，时间一般是30s，要是片段长的话可以适当延长，最长我试过2min，主要还是温度，时间的影响不会特别大
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7楼2010-08-25 17:53:41
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大飞370

铜虫 (小有名气)
★
看天(金币+1):活跃 2010-08-26 12:31:33
退火温度主要是依据GC含量，你还是多看看书吧。一半Tm值引物公司会给你。
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2楼2010-08-25 11:19:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+1):鼓励 2010-08-26 12:31:45
50mM Na+的Tm值加5~10度即可作为退火温度，时间一般15s~20s足够
经典的Taq酶合成速度是1kb/min
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-08-25 11:24:29
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banhf

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):good 2010-08-25 20:41:44
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
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4楼2010-08-25 14:35:21
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