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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR退火温度
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嘉笛

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR退火温度

请大家帮忙看下面的引物，退火温度应该设为多少？或整个PCR程序应该怎么设定？目的基因片段全长705bp，请大家告诉具体数值或操作步骤，不要写一些公式或软件，谢谢啦！
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTGGTGGTTCTG-3’
Antisense primers  5’-ATGTGCGGCCGCTTATCATGTAGAAAACTTTGTATCCA-3’
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1楼 2010-12-21 16:00:24
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feiye2214

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
rainwander(金币+1):呵呵，鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:11:21
silicare(金币+2):教育意义更精彩 2010-12-22 08:43:10
引用回帖:
Originally posted by 嘉笛 at 2010-12-21 16:00:24:
请大家帮忙看下面的引物，退火温度应该设为多少？或整个PCR程序应该怎么设定？目的基因片段全长705bp，请大家告诉具体数值或操作步骤，不要写一些公式或软件，谢谢啦！
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTG ...

伸手党
公司给你合成引物的时候，不是附了合成单了吗，上面有
一般程序：94 5min 94 30s Tm 30s 72 1min 33cycles 72 10min end
其实Tm可以做个梯度试试
多看看文献吧，不要纯伸手啦
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2楼2010-12-21 16:12:04
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:11:26
1949stone(金币+2):很热心 继续鼓励 2010-12-21 22:45:14
你不想知道为什么要选这些数值的话，我可以告诉你：
两条引物的Tm分别为：Sence：61.66，antisence：66.66
反应程序：
94 5min
以下5个循环
94 30s
56 30s
72 45s
循环结束
以下25个循环
94 30s
63 30s
72 45s
循环结束

72 10min
4   hold
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3楼2010-12-21 16:22:15
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天使托

专家顾问 (职业作家)
果然是伸手党!自己动手，丰衣足食！
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4楼2010-12-21 16:22:41
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-22 08:40:19
引用回帖:
Originally posted by 嘉笛 at 2010-12-21 16:00:24:
请大家帮忙看下面的引物，退火温度应该设为多少？或整个PCR程序应该怎么设定？目的基因片段全长705bp，请大家告诉具体数值或操作步骤，不要写一些公式或软件，谢谢啦！
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTG ...

退火温度60度左右吧，如果想摸条件，做一个梯度PCR就行了
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5楼2010-12-21 19:07:25
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嘉笛

木虫 (小有名气)
★
silicare(金币+1):如果你连基本概念都不清楚你觉得这个实验能往下继续吗，鼓励一下新手，还是先学习一下教科书吧 2010-12-22 08:44:18
我学药物分析的，开始都不知道什么是Tm
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6楼2010-12-22 08:35:19
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xiefl1984

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-02-24 09:10:45
嘉笛(金币+20): 谢谢 2011-03-01 15:12:35
sense primer
Tm（1M Na+）       75.4
Tm（50mM Na+）     53.8
%GC                40
Anti Primer     
Tm（1M Na+）       81
Tm（50mM Na+）     59.4
%GC                42.1
可以参照以上数据先做梯度PCR，再进一步确定特异性较好的退火温度
希望对你有帮助
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7楼2011-02-24 08:38:49
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cyz20050505

木虫 (正式写手)
退火温度有啥好纠结的，一般的PCR，管你什么引物上去就55读退火，不行再调，很多时间上下浮动5度甚至10度都是没有好大的区别。
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8楼2011-02-24 19:34:42
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doubleshen

银虫 (小有名气)
二楼好神奇，怎么知道的这么详细呀？
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9楼2011-02-24 22:56:53
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