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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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嘉笛

木虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】PCR退火温度

请大家帮忙看下面的引物,退火温度应该设为多少?或整个PCR程序应该怎么设定?目的基因片段全长705bp,请大家告诉具体数值或操作步骤,不要写一些公式或软件,谢谢啦!
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTGGTGGTTCTG-3’
Antisense primers  5’-ATGTGCGGCCGCTTATCATGTAGAAAACTTTGTATCCA-3’
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feiye2214

木虫 (正式写手)


★ ★ ★
rainwander(金币+1):呵呵,鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:11:21
silicare(金币+2):教育意义更精彩 2010-12-22 08:43:10
引用回帖:
Originally posted by 嘉笛 at 2010-12-21 16:00:24:
请大家帮忙看下面的引物,退火温度应该设为多少?或整个PCR程序应该怎么设定?目的基因片段全长705bp,请大家告诉具体数值或操作步骤,不要写一些公式或软件,谢谢啦!
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTG ...

伸手党
公司给你合成引物的时候,不是附了合成单了吗,上面有
一般程序:94 5min 94 30s Tm 30s 72 1min 33cycles 72 10min end
其实Tm可以做个梯度试试
多看看文献吧,不要纯伸手啦
2楼2010-12-21 16:12:04
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yabxxh

木虫 (正式写手)


★ ★ ★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:11:26
1949stone(金币+2):很热心 继续鼓励 2010-12-21 22:45:14
你不想知道为什么要选这些数值的话,我可以告诉你:
两条引物的Tm分别为:Sence:61.66,antisence:66.66
反应程序:
94 5min
以下5个循环
94 30s
56 30s
72 45s
循环结束
以下25个循环
94 30s
63 30s
72 45s
循环结束

72 10min
4   hold
3楼2010-12-21 16:22:15
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果然是伸手党!自己动手,丰衣足食!
4楼2010-12-21 16:22:41
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rioarsenal

金虫 (正式写手)



dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-22 08:40:19
引用回帖:
Originally posted by 嘉笛 at 2010-12-21 16:00:24:
请大家帮忙看下面的引物,退火温度应该设为多少?或整个PCR程序应该怎么设定?目的基因片段全长705bp,请大家告诉具体数值或操作步骤,不要写一些公式或软件,谢谢啦!
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTG ...

退火温度60度左右吧,如果想摸条件,做一个梯度PCR就行了
5楼2010-12-21 19:07:25
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嘉笛

木虫 (小有名气)



silicare(金币+1):如果你连基本概念都不清楚你觉得这个实验能往下继续吗,鼓励一下新手,还是先学习一下教科书吧 2010-12-22 08:44:18
我学药物分析的,开始都不知道什么是Tm
6楼2010-12-22 08:35:19
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xiefl1984

木虫 (小有名气)


★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-02-24 09:10:45
嘉笛(金币+20): 谢谢 2011-03-01 15:12:35
sense primer
Tm(1M Na+)       75.4
Tm(50mM Na+)     53.8
%GC                40
Anti Primer     
Tm(1M Na+)       81
Tm(50mM Na+)     59.4
%GC                42.1
可以参照以上数据先做梯度PCR,再进一步确定特异性较好的退火温度
希望对你有帮助
7楼2011-02-24 08:38:49
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cyz20050505

木虫 (正式写手)


退火温度有啥好纠结的,一般的PCR,管你什么引物上去就55读退火,不行再调,很多时间上下浮动5度甚至10度都是没有好大的区别。
8楼2011-02-24 19:34:42
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doubleshen

银虫 (小有名气)


二楼好神奇,怎么知道的这么详细呀?
9楼2011-02-24 22:56:53
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