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嘉笛

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】PCR退火温度

请大家帮忙看下面的引物，退火温度应该设为多少？或整个PCR程序应该怎么设定？目的基因片段全长705bp，请大家告诉具体数值或操作步骤，不要写一些公式或软件，谢谢啦！
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTGGTGGTTCTG-3’
Antisense primers 5’-ATGTGCGGCCGCTTATCATGTAGAAAACTTTGTATCCA-3’

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1楼 2010-12-21 16:00:24

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cyz20050505

木虫 (正式写手)

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退火温度有啥好纠结的，一般的PCR，管你什么引物上去就55读退火，不行再调，很多时间上下浮动5度甚至10度都是没有好大的区别。

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8楼2011-02-24 19:34:42

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feiye2214

木虫 (正式写手)

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★ ★ ★
rainwander(金币+1):呵呵，鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:11:21
silicare(金币+2):教育意义更精彩 2010-12-22 08:43:10

引用回帖:

Originally posted by 嘉笛 at 2010-12-21 16:00:24:
请大家帮忙看下面的引物，退火温度应该设为多少？或整个PCR程序应该怎么设定？目的基因片段全长705bp，请大家告诉具体数值或操作步骤，不要写一些公式或软件，谢谢啦！
Sense primers 5’-ATCTCGAGAAAAGAATTGTTG ...

伸手党

公司给你合成引物的时候，不是附了合成单了吗，上面有
一般程序：94 5min 94 30s Tm 30s 72 1min 33cycles 72 10min end
其实Tm可以做个梯度试试
多看看文献吧，不要纯伸手啦

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2楼2010-12-21 16:12:04

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yabxxh

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:11:26
1949stone(金币+2):很热心继续鼓励 2010-12-21 22:45:14

你不想知道为什么要选这些数值的话，我可以告诉你：
两条引物的Tm分别为：Sence：61.66，antisence：66.66
反应程序：
94 5min
以下5个循环
94 30s
56 30s
72 45s
循环结束
以下25个循环
94 30s
63 30s
72 45s
循环结束

72 10min
4 hold

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3楼2010-12-21 16:22:15

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