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PCR退火温度已有2人参与
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各位虫友大家好！ 我拿到的引物退火温度一个是69度，一个62度，PCR程序退火温度设多少合适呀？我做的梯度是从52到65的，低温时在2000和1500左右有微弱的条带（目的条带900左右），中间温度扩出来的在250到100之间有明亮的引物二聚体，高温没有任何条带。 我想再重新p一次，请问大家，从这种结果看，我的退火温度取什么范围的梯度合适呀？还是要重新设计引物？ O(∩_∩)O谢谢~~ |
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wangqk198738
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genetics183
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smallcat227
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8楼2009-08-14 17:58:45
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楼主，可以的话，把你的反应条件也说下。。。 我做PCR多，有些经验，一般两次就能把东西扩出来。。 你的退火温度我建议选55到60之间。 按照你说的情况，我认为的你的延伸时间有点过高了。如果你的模板是质粒，应该很轻松就可以扩了。。如果你的模板是真核基因组的话，可以加一些DMSO。 我建议你的反应条件可以这样: 95度，3分 95度20秒，60度30秒，72度1分，（循环数你要看你的模板浓度自己定，一般真核基因组用30到35个循环） 72度3分。 切记，如果是真核基因组的话，加一些DMSO。 如果还不行，可以尝试TOUCH DOWN PCR。。。即退火温度从65度到55度每个循环降一度，再55度退火保持20多个循环。。 祝顺利 |
10楼2009-08-14 19:47:48