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nininini银虫 (小有名气)
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关于real-time PCR温度优化的问题
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| 第一次实验温度Tm=58度，Cp值22左右，后来相同体系，Tm=66度，结果Cp值降到了9左右，三四个基因都是这样，请问这是什么原因呢，结果可靠吗？ |
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adslye
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【答案】应助回帖
nininini(金币+3): 2011-05-28 17:53:29
nininini(金币+1): 2011-07-18 08:51:46
nininini(金币+1): 2011-07-18 08:51:46
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你的意思是同一基因，同一体系，只是退火温度不同。CT值差了10以上对吧？ 那你这个肯定有问题。3.3个CT基本就是模板量差10倍。 你是探针法还是染料法。确定没有副产物吧? CT差10有可能是产物和引物二聚体的差别。 建议你换2步法P下。 95°5s 66°30s 看下。 你的引物退火温度多少？为什么要选这两个温度？如果你要摸条件，那就直接做个梯度，你这样2个温度做下来没意义。 强烈建议做个NTC组，确认下2种温度下的产物，看有没有非特异性产物。 |
7楼2011-05-28 16:36:26
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【答案】应助回帖
nininini(金币+5): 谢谢详细回复 2011-05-28 11:35:00
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感觉Cp=22太高了。 虽然Cp值多少都是现实情况的反应。跟Cp有关的因素其实也就是PCR反应产物量的影响因素。比如:模板量，扩增效率等。也就是说Cp和产物的量相关。 而Tm主要和精度有关（当然也会影响扩增效率以及扩增），但在荧光定量PCR中我们调节Tm是为了更单一的产物，特别是在用染料法的时候。也就是说Tm和精度有关。 你前后实验都有重复试过吗？如果都是相同条件只是Tm不同且是在有一定重复性下得到的可信结果。 那我觉得你要做： 1.扩增效率考证。。做一个在不同温度下的扩增效率对比。 2.试剂确定没问题。 3.程序设置与试剂相符合。有些公司酶是要热变性，有些快速酶，有些是标准酶。 4.扩大体系，抬高平台期和基线期距离，看看与原体系差别。理论上CT值是一样的。 5.看是否有背景污染。用水做对照。 个人感觉，只是Tm变，Cp差太大了，应该是扩增效率差别很大造成的。 另外： 1.CT差别有多大？ 2.你是两步法还是三步法PCR？ 你的情况我没遇到过。顺便学习。 |
2楼2011-05-28 11:24:30
nininini
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3楼2011-05-28 11:38:23
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4楼2011-05-28 11:41:31
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