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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RT-real time pcr问题
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】RT-real time pcr问题 已有2人参与

我是新手 请高手不吝赐教
我是做β微管蛋白基因的相对基因表达差异，以β-ACTIN为内参基因，在前面的RT-PCR中我得到的rna是否可以不用电泳鉴定就直接可以用于后面的cDNA转录，因为电泳槽经常跑DNA，我担心rna鉴定时被降解
在荧光定量pcr之前我要用得到的cDNA分别以β微管蛋白基因引物和β-ACTIN内参基因引物来进行pcr扩增，以检测cDNA是否搞出来了，如果我摸索出了他们的较佳的pcr反应条件那我以后是否就可以省略这步直接在荧光定量pcr上来进行相对定量pcr检测  
谢谢
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三人行必有我师
1楼 2010-08-23 14:51:10
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mafang68

金虫 (著名写手)
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amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-08-23 20:58:47
RNA降解是因为RNA酶的存在，跟你的电泳槽跑DNA无关。
你检测CDNA时只跑actin即可；  摸索出RT-PCTR条件后，可直接省略此步骤。
其实，你验证的仅是你逆转的CDNA质量如何。
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木虫啦，哈哈
2楼2010-08-23 15:09:31
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chendarid0

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by mafang68 at 2010-08-23 15:09:31:
RNA降解是因为RNA酶的存在，跟你的电泳槽跑DNA无关。
你检测CDNA时只跑actin即可；  摸索出RT-PCTR条件后，可直接省略此步骤。
其实，你验证的仅是你逆转的CDNA质量如何。

谢这位高手。你的意思是必须进行rna电泳鉴定。那我进行rna电泳鉴定时电泳槽可以不用DEPC水洗，可以不用新胶和新缓冲液吗？我看到好像有人用甲醛的凝胶电泳，而且电泳槽还要用酸还是碱洗（我好像有点忘了），过氧水洗，还得高温烘干，好像太费事了

摸索出rt-pcr条件后我省略此步普通pcr那我的cDNA怎么保证质量可以呢
谢谢
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三人行必有我师
3楼2010-08-23 15:35:05
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mafang68

金虫 (著名写手)
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看天(金币+1):热心 2010-08-24 09:19:25
呵呵，你理解错了，我的意思是不用进行RNA鉴定。我们提的次数多了，直接逆转CDNA后跑RT-PCR。就看你提RNA的水平能不能过关了
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木虫啦，哈哈
4楼2010-08-23 20:43:30
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chendarid0

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by mafang68 at 2010-08-23 20:43:30:
呵呵，你理解错了，我的意思是不用进行RNA鉴定。我们提的次数多了，直接逆转CDNA后跑RT-PCR。就看你提RNA的水平能不能过关了

谢谢你的指点，你的意思是rna电泳鉴定可以省略，但是得到的每个cDNA都要以actin引物来进行普通pcr鉴定，没有问题再进行荧光定量pcr
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三人行必有我师
5楼2010-08-24 08:58:33
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mafang68

金虫 (著名写手)
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reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-08-25 09:44:16
呵呵，也不是。只要你能确保你提的RNA质量好，不必用普通PCR来验证，直接跑RT-PCR即可。所以，你需要的就是多联系RNA提取技术
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木虫啦，哈哈
6楼2010-08-24 20:50:39
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chendarid0

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by mafang68 at 2010-08-24 20:50:39:
呵呵，也不是。只要你能确保你提的RNA质量好，不必用普通PCR来验证，直接跑RT-PCR即可。所以，你需要的就是多联系RNA提取技术

谢谢你的指点
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三人行必有我师
7楼2010-08-25 08:34:28
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