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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR得到几条带，怎么办
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR得到几条带，怎么办

我自己设计了几种引物，目的是从金黄色葡萄球菌总DNA调取其中一段二三百bp左右的基因片段。做了touchdownPCR后,其中一种引物PCR后得到了两个条带，一条>500bp,一条300bp左右（图1中1、2）；还有一种引物得到三个条带（图1中3、4），是什么原因呢 ？然后我将这几个条带分别挖胶，将得到的胶F分别加入PCR管中作为模板再进行PCR，但是得到的电泳图像却与之前的相似（图2），我不能理解为什么挖胶得到的较小片段PCR后仍能得到较大的片段（图2中泳道1、2、3、4） ，剩余几个挖胶条带PCR后得到的是一片亮光？还有我设计的引物为什么会得到2个和3个条带啊？有什么好办法解决？
图1：
图2：
  
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1楼 2010-11-19 14:53:56
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
lstt09nk(金币+2):鼓励交流 2010-11-19 17:38:23
引物的特异性不够，不妨将两条带都回收，然后连T测序，反正就几十块钱。

不知道你的胶回收产物做模板的时候稀释了没有，要是不稀释加上你的引物特异性不够的话，是会smear的。
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2楼2010-11-19 17:07:17
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zgb1982

木虫 (正式写手)
最下面那条应该是引物二聚体吧。出现两面条带应该是引物特异性问题，提高退火温度试试撒。不懂乱说的
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3楼2010-11-19 17:19:09
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yade

新虫 (小有名气)
很多PCR都会出现这种情况，一个是提高退火温度试试，另外可以尝试把TD-PCR改为普通PCR。
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4楼2010-11-21 12:33:25
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傻子

木虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 10:49:10
做梯度PCR优化退火温度，同时考虑用hot-star taq酶实验。适当降低模板和引物的浓度。如果都不行，换引物吧
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5楼2010-11-22 09:46:23
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