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lilirong2009

铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】PCR得到几条带,怎么办

我自己设计了几种引物,目的是从金黄色葡萄球菌总DNA调取其中一段二三百bp左右的基因片段。做了touchdownPCR后,其中一种引物PCR后得到了两个条带,一条>500bp,一条300bp左右(图1中1、2);还有一种引物得到三个条带(图1中3、4),是什么原因呢 ?然后我将这几个条带分别挖胶,将得到的胶F分别加入PCR管中作为模板再进行PCR,但是得到的电泳图像却与之前的相似(图2),我不能理解为什么挖胶得到的较小片段PCR后仍能得到较大的片段(图2中泳道1、2、3、4) ,剩余几个挖胶条带PCR后得到的是一片亮光?还有我设计的引物为什么会得到2个和3个条带啊?有什么好办法解决?
图1:
图2:
  
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lstt09nk(金币+2):鼓励交流 2010-11-19 17:38:23
引物的特异性不够,不妨将两条带都回收,然后连T测序,反正就几十块钱。

不知道你的胶回收产物做模板的时候稀释了没有,要是不稀释加上你的引物特异性不够的话,是会smear的。
2楼2010-11-19 17:07:17
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zgb1982

木虫 (正式写手)


最下面那条应该是引物二聚体吧。出现两面条带应该是引物特异性问题,提高退火温度试试撒。不懂乱说的
3楼2010-11-19 17:19:09
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yade

新虫 (小有名气)


很多PCR都会出现这种情况,一个是提高退火温度试试,另外可以尝试把TD-PCR改为普通PCR。
4楼2010-11-21 12:33:25
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傻子

木虫 (正式写手)



lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 10:49:10
做梯度PCR优化退火温度,同时考虑用hot-star taq酶实验。适当降低模板和引物的浓度。如果都不行,换引物吧
5楼2010-11-22 09:46:23
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