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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教PCR条件优化
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ap

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教PCR条件优化

以真菌基因组为模板PCR基因，得到的目的带很弱，请教如何优化PCR条件

目的片段为1141bp，
第一次PCR电泳图请见图1

真菌A的基因组作为模板
1~6，7~12为不同的引物，分别为引物对m和引物对n（引物对m和引物对n的3‘端一样，5’有不同的酶切位点和保护碱基）
1~3 基因组模板未稀释，1~3，退火温度分别为47,49,50
4~6基因组模板稀释10* ，4~6退火温度分别为47,49,50
分析发现，模板不稀释，PCR产物较浓，模板稀释10倍，影响不大，退火温度高时，PCR产物产量较小。

第二次PCR电泳图请见图2

真菌A和B的基因组作为模板
引物为n
1，2  分别为B菌种基因组稀释10*，100*，作为模板
3~6为菌种A 基因组为模板
3,4为基因组10*稀释，分别为退火温度50, 52
5,6为基因组100倍稀释，分别为退火温度50, 52
结论：1,100*稀释PCR产物太淡
      2,52℃退火比50℃退火杂带少
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1楼 2010-10-17 18:33:45
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
ap(金币+10): 2010-10-17 19:05:11
楼主这属于特异扩增，一般说来，你加的不同的酶切位点和保护碱基应该影响不大，看得出，你的非特异带很多，你想了办法，提高退火，杂带有所减少，说明退火温度有点作用，但是你的目的带还是很弱。
根据你的图，我觉得，你可以把延伸时间缩短点，也许能去掉那些大片段，
你的目的带很弱，是否可以把模板不稀释，直接上2微升试试看

此外，你的目的应该i是回收然后酶切，要是实在还是不好弄，多做几管，回收应该没有问题的，呵呵，你觉得呢
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2楼2010-10-17 18:53:58
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by taigongzaici at 2010-10-17 18:53:58:
楼主这属于特异扩增，一般说来，你加的不同的酶切位点和保护碱基应该影响不大，看得出，你的非特异带很多，你想了办法，提高退火，杂带有所减少，说明退火温度有点作用，但是你的目的带还是很弱。
根据你的图，我 ...

谢谢！
不稀释的模板在之前做过，和稀释十倍的差不多。
我也想如果实在没办法，就切胶回收试试看。
非常感谢！
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3楼2010-10-17 19:07:21
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流。 2010-10-17 20:04:45
引用回帖:
Originally posted by ap at 2010-10-17 19:07:21:

谢谢！
不稀释的模板在之前做过，和稀释十倍的差不多。
我也想如果实在没办法，就切胶回收试试看。
非常感谢！

很乐意交流，我兼并引物做过同源克隆，开始我老是跑不出来，设计N多引物，最后我一生气，直接把cNDA（没稀释的原液）加了4微升（PCR是20体系的），立马出带了，虽然说模板过多可能弥散，但是也是很有效的，你不妨试试看
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4楼2010-10-17 19:14:31
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
好好做块胶吧，琼脂糖浓度加大点
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5楼2010-10-17 23:24:08
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-10-17 23:24:08:
好好做块胶吧，琼脂糖浓度加大点

能具体解释吗？谢谢！
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6楼2010-10-18 08:56:59
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-18 09:51:16
ap(金币+2): 2010-10-18 11:09:45
引用回帖:
Originally posted by ap at 2010-10-17 18:33:45:
以真菌基因组为模板PCR基因，得到的目的带很弱，请教如何优化PCR条件

目的片段为1141bp，
第一次PCR电泳图请见图1

真菌A的基因组作为模板
1 ...

这人老手了
要我出这结果我肯定不稀释，先提高温度试试看，升高温度杂带肯定会相应的减少，如果能达到结果就完美了，如果目的片段也跟着没了就说明这对引物不是很好，需要像楼上说的只能现在把目的片段切胶回收了再扩了。不用担心样本浓度大出弥散，起码你现在没稀释的情况都片段不是很亮呢，所以这方面没问题。
另外，片段越小琼脂糖胶的浓度应该越高。
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7楼2010-10-18 09:47:16
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蓝天白云haha

银虫 (正式写手)
这块胶确实做的不好，条带都扭曲了
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8楼2010-10-21 10:27:44
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lxjwishes

银虫 (正式写手)
引物不特异  重先弄一对引物吧
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pleasemywings,flymeaway.
9楼2010-10-21 11:24:20
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langduiyue

银虫 (小有名气)
LZ,    因为你做了两组引物，明显两者有一定的差异。建议LZ可以再查看一下是不是引物的问题是不是存在二聚体，茎环。
不知LZ引物有多长，如果是长引物的话，建议做一下退火温度 和时间的梯度实验室，因为长引物缩短退火时间比较好。最后再查看一下扩增片段的TM值的情况，着情调整一下 延伸温度
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角逐自我
10楼2010-10-21 12:49:04
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