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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】样品PCR老是涂抹带是怎么回事
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wwling

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】样品PCR老是涂抹带是怎么回事 已有9人参与

用质粒扩增结果很好，但一用样品扩就是涂抹带啊[img]
[img][/img]
图中那个条带是阳性对照，质粒做的，其余全都是样品PCR，体系一样
希望大家帮忙分析下什么原因~
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1楼 2010-11-22 21:07:58
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铯铯

木虫 (小有名气)
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scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-22 23:13:02
用的maker是DL2000么，目的带是500bp？感觉有些上样孔可能有目的扩增带，不过感觉更多的都是引物二聚体，建议把引物浓度降低一点（25微升体系，用0.1微摩就足够了），引物是很灵敏的，还可以把扩增温度稍稍提高一两度，当然要保证阳性对照也能扩增出来
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2楼2010-11-22 21:18:38
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wwling

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 铯铯 at 2010-11-22 21:18:38:
用的maker是DL2000么，目的带是500bp？感觉有些上样孔可能有目的扩增带，不过感觉更多的都是引物二聚体，建议把引物浓度降低一点（25微升体系，用0.1微摩就足够了），引物是很灵敏的，还可以把扩增温度稍稍提高一 ...

谢谢回复 我的20ul体系 用了0.4uM  嗯 明天降低下看看
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3楼2010-11-22 21:33:24
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adslye

银虫 (正式写手)
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Originally posted by wwling at 2010-11-22 21:33:24:



谢谢回复 我的20ul体系 用了0.4uM  嗯 明天降低下看看

除了上面的，建议你可以少上点样 。或者PCR循环数少点。太亮了，
有时候我基因组上样多了，也是一团，稀释后就是单一带了。

我个人认为，不是PCR的问题，是胶和上样的问题。
如果排除了胶和上样，建议你换一个酶，试试高保真的。我用生工的酶P过和
你类似的，换高保真后就没问题了。

[ Last edited by adslye on 2010-11-22 at 22:24 ]
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4楼2010-11-22 22:23:33
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胖胖113

新虫 (小有名气)
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-23 08:44:21
条带有点亮，试试降低引物浓度，如果效果不明显，试试减少循环次数，还有让PCR仪适当的休息一下，然后再做。
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5楼2010-11-23 01:07:56
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langduiyue

银虫 (小有名气)
加大 mg2+ 的浓度
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角逐自我
6楼2010-11-23 08:23:22
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85715623

木虫 (正式写手)
★
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模板浓度太高了，应该稀释
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7楼2010-11-23 08:43:37
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jane20067879

银虫 (小有名气)
★
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我也曾遇到这样的问题。
你可以试试提高退火温度；减低引物的浓度；稀释一下DNA样品；
或者再做一下二次PCR。
每次改变一个条件，其他条件不变，就可以查出是什么问题导致的。
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给力，2011
8楼2010-11-23 08:46:41
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
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尽量不要用PCR产物做模板，有质粒就用质粒。这样会避免很多麻烦。
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9楼2010-11-23 11:10:21
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wwling

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-11-22 22:23:33:


除了上面的，建议你可以少上点样 。或者PCR循环数少点。太亮了，
有时候我基因组上样多了，也是一团，稀释后就是单一带了。

我个人认为，不是PCR的问题，是胶和上样的问题。
如果排除了胶和上样，建议你 ...

嗯 上样少点后的确可以没那么明显 不过还是涂抹带 目的条带很淡
你提到用PFU酶 以前也有人这样建议过 不知道是什么原理呢？ 我的酶在普通PCR上样品扩得还可以 但是一上定量PCR仪器 就只有质粒出来条带
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10楼2010-11-23 14:55:54
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