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深蓝色竹子

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增不出目的条带

我是用cDNA为模板(已经确定没问题),进行扩增1500bp的基因,都换了两次引物了,每次都会在500bp左右扩增出很亮的条带,阴性对照也有这条带,但是目的条带几乎木有,都一个月了,就是扩增不出来,请各位给予指导

dell 2013-01-15 18hr 38min.jpg
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qiyaocheng

木虫 (小有名气)

老虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
所有试剂换新的,把水好好灭菌
毕业回望科研路,满目疮痍一身土
8楼2013-01-26 22:28:48
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普通回帖

深蓝色竹子

新虫 (小有名气)

我用的是5000Maker,大小一次为5000,3000,2000,1000,750,500,250,100,我用的是高保真的酶,Mix也用过同样的情况!
2楼2013-01-24 19:46:23
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
换用GC rich buffer试一试,可能是产物GC含量高
另外,你有不止一对引物,可以尝试巢氏PCR
3楼2013-01-24 20:12:23
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深蓝色竹子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yesali at 2013-01-24 20:12:23
换用GC rich buffer试一试,可能是产物GC含量高
另外,你有不止一对引物,可以尝试巢氏PCR

我是扩增的全长,要做表达的,但是我的目的记忆总的GC含量才43%,应该不算太高吧
4楼2013-01-24 21:43:36
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

总的GC含量不高,但是不排除某一个区域GC含量高,PCR到这个区域后可能延伸不下去
5楼2013-01-25 09:03:27
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主,如何确定cDNA没有问题?
最大的可能就是引物没设计好,请再提高退火温度试试或者减少引物的量,你的所有样品扩增都是smear,如果还不行,请重新设计引物。
6楼2013-01-25 10:39:19
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我个人觉得是你的引物的问题,引物设计得不是很好,可以提高退火温度去跑试试看,实在不行重新设计引物吧!
7楼2013-01-25 11:48:01
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木--林--森

铜虫 (小有名气)

我今天的PCR扩增也失败了,找不出原因!
没有什么了不起的!
9楼2013-01-28 00:26:27
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dkyy970111

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

实在不行换一步法RT-PCR试剂盒。
打铁还要自身硬
10楼2013-01-28 16:01:32
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