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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
高照李: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-11-23 21:42:25
引用回帖:
10楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-23 12:01:04
今天刚刚作出一个梯度PCR,是另外一种同科不同亚科的虫子,模板浓度大约400-600ng,体系引物10mM1.5微升,退火温度梯度40-50℃(图片中从左到右40℃、40.9℃、42.3℃、43.9℃、DNAmarker1000、46.3℃、48.1℃、49. ...

43.9(第四道)就挺好的;你确定顺序没搞错就好。一般都是过高或过低都不好。还有就是习惯上,上样孔在上面。
11楼2012-11-23 12:06:14
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高照李

木虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-23 12:06:14
43.9(第四道)就挺好的;你确定顺序没搞错就好。一般都是过高或过低都不好。还有就是习惯上,上样孔在上面。...

好的,多谢多谢。
12楼2012-11-23 21:42:19
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reallpf

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-22 23:09:23
多谢学长回复,我这两天有重做了,温度梯度还是没做出来,模板浓度梯度、酶浓度梯度也做了还是没出。引物空白对照也做了,引物没问题。我做的是几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段,目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增 ...

尽量不要用Mix做PCR扩增,出错率相对较高,而且最后还有A尾。

抱歉刚看到你回复问我。
对于你的体系,我不清楚你的引物GC含量值。个人保守建议:对于50 uL体系,换高保真酶PrimeSTAR;引物加1.25 - 2 uL(在你的引物浓度基础上);模版1.5 uL。同时减少变性时间和退火时间到30 s;提高退火温度,减少延伸时间(Mix一般一分钟能到2000 bp吧?),减少循环数到30。
如果你的PCR电泳有条带,最好上传电泳图看看。
同时对于PCR长久不能得到目标特异片段,可以改用小体系(如10或20 uL)

另外,你怎么确定你的引物没有问题?我指的问题是特异性,这个实验你怎么确定呢?改用上述体系还做不出来建议从两方面考虑问题:

1.你的模板:你有没有提出线粒体DNA?这个需要确定。
2.重新设计引物,提高GC含量值,增加引物长度。从而提高引物特异性。
13楼2012-11-26 09:52:57
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reallpf

木虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-23 12:01:04
今天刚刚作出一个梯度PCR,是另外一种同科不同亚科的虫子,模板浓度大约400-600ng,体系引物10mM1.5微升,退火温度梯度40-50℃(图片中从左到右40℃、40.9℃、42.3℃、43.9℃、DNAmarker1000、46.3℃、48.1℃、49. ...

看到你的图和描述,认为提高模板浓度和引物量是有必要的。

你的电泳图没有标注条带大小,而且方向反了。不清楚你扩增得到的条带是否正确。

另外你的退火温度太低,着说明引物的特异性很低,对后续实验不宜。PCR退火温度一般在48 —— 62度。

个人建议
14楼2012-11-26 09:58:04
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