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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求解PCR问题《忘记加水的前后》
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
高照李: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-11-23 21:42:25
引用回帖:
10楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-23 12:01:04
今天刚刚作出一个梯度PCR，是另外一种同科不同亚科的虫子，模板浓度大约400-600ng，体系引物10mM1.5微升，退火温度梯度40-50℃（图片中从左到右40℃、40.9℃、42.3℃、43.9℃、DNAmarker1000、46.3℃、48.1℃、49. ...

43.9（第四道）就挺好的；你确定顺序没搞错就好。一般都是过高或过低都不好。还有就是习惯上，上样孔在上面。
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11楼2012-11-23 12:06:14
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高照李

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-23 12:06:14
43.9（第四道）就挺好的；你确定顺序没搞错就好。一般都是过高或过低都不好。还有就是习惯上，上样孔在上面。...

好的，多谢多谢。
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12楼2012-11-23 21:42:19
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-22 23:09:23
多谢学长回复，我这两天有重做了，温度梯度还是没做出来，模板浓度梯度、酶浓度梯度也做了还是没出。引物空白对照也做了，引物没问题。我做的是几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段，目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增 ...

尽量不要用Mix做PCR扩增，出错率相对较高，而且最后还有A尾。

抱歉刚看到你回复问我。
对于你的体系，我不清楚你的引物GC含量值。个人保守建议：对于50 uL体系，换高保真酶PrimeSTAR；引物加1.25 - 2 uL（在你的引物浓度基础上）；模版1.5 uL。同时减少变性时间和退火时间到30 s；提高退火温度，减少延伸时间（Mix一般一分钟能到2000 bp吧？），减少循环数到30。
如果你的PCR电泳有条带，最好上传电泳图看看。
同时对于PCR长久不能得到目标特异片段，可以改用小体系（如10或20 uL）

另外，你怎么确定你的引物没有问题？我指的问题是特异性，这个实验你怎么确定呢？改用上述体系还做不出来建议从两方面考虑问题：

1.你的模板：你有没有提出线粒体DNA？这个需要确定。
2.重新设计引物，提高GC含量值，增加引物长度。从而提高引物特异性。
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13楼2012-11-26 09:52:57
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-23 12:01:04
今天刚刚作出一个梯度PCR，是另外一种同科不同亚科的虫子，模板浓度大约400-600ng，体系引物10mM1.5微升，退火温度梯度40-50℃（图片中从左到右40℃、40.9℃、42.3℃、43.9℃、DNAmarker1000、46.3℃、48.1℃、49. ...

看到你的图和描述，认为提高模板浓度和引物量是有必要的。

你的电泳图没有标注条带大小，而且方向反了。不清楚你扩增得到的条带是否正确。

另外你的退火温度太低，着说明引物的特异性很低，对后续实验不宜。PCR退火温度一般在48 —— 62度。

个人建议
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14楼2012-11-26 09:58:04
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