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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求解PCR问题《忘记加水的前后》
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高照李

木虫 (正式写手)

[求助] 求解PCR问题《忘记加水的前后》

我要扩增昆虫线粒体DNA的一个片段，前天做退火温度的梯度PCR实验时时侯忙中出错忘记加水了（需定容至50微升），扩出的结果用琼脂糖凝胶电泳检测时发现有3 个温度的样本有片段（40-52度的梯度，41.6度、48度和50度的有，41.6度的最亮），且和需要的大小相近，其它温度的样本则没有扩出。我又重新做了一遍退火温度的梯度PCR（所有试剂都加好了无遗漏），但什么也没出。
      请问这是什么原因？请问哪位大侠知道。
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1楼 2012-11-22 19:54:18
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
高照李: 回帖置顶 2012-11-23 21:43:33
你的问题可能有2种情况

一是偶然情况，在实验中可能会碰到相同的体系分装几管做PCR，仅仅因为放的位置不同结果也不同。
二是你的PCR体系的缓冲液或者镁离子的配比浓度有问题，造成是否加水的不同结果。

所以碰到这样的情况深究起来很复杂。建议还是重新优化反应体系和PCR条件。

在多个温度梯度都没有条带且重复出现没有条带的情况下，需要调整引物特异性、退火时间、模版浓度和酶浓度。
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2楼2012-11-22 20:15:36
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-22 23:09:23
多谢学长回复，我这两天有重做了，温度梯度还是没做出来，模板浓度梯度、酶浓度梯度也做了还是没出。引物空白对照也做了，引物没问题。我做的是几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段，目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增 ...

尽量不要用Mix做PCR扩增，出错率相对较高，而且最后还有A尾。

抱歉刚看到你回复问我。
对于你的体系，我不清楚你的引物GC含量值。个人保守建议：对于50 uL体系，换高保真酶PrimeSTAR；引物加1.25 - 2 uL（在你的引物浓度基础上）；模版1.5 uL。同时减少变性时间和退火时间到30 s；提高退火温度，减少延伸时间（Mix一般一分钟能到2000 bp吧？），减少循环数到30。
如果你的PCR电泳有条带，最好上传电泳图看看。
同时对于PCR长久不能得到目标特异片段，可以改用小体系（如10或20 uL）

另外，你怎么确定你的引物没有问题？我指的问题是特异性，这个实验你怎么确定呢？改用上述体系还做不出来建议从两方面考虑问题：

1.你的模板：你有没有提出线粒体DNA？这个需要确定。
2.重新设计引物，提高GC含量值，增加引物长度。从而提高引物特异性。
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13楼2012-11-26 09:52:57
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-23 12:01:04
今天刚刚作出一个梯度PCR，是另外一种同科不同亚科的虫子，模板浓度大约400-600ng，体系引物10mM1.5微升，退火温度梯度40-50℃（图片中从左到右40℃、40.9℃、42.3℃、43.9℃、DNAmarker1000、46.3℃、48.1℃、49. ...

看到你的图和描述，认为提高模板浓度和引物量是有必要的。

你的电泳图没有标注条带大小，而且方向反了。不清楚你扩增得到的条带是否正确。

另外你的退火温度太低，着说明引物的特异性很低，对后续实验不宜。PCR退火温度一般在48 —— 62度。

个人建议
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14楼2012-11-26 09:58:04
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