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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 梯度PCR的问题
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微微卫10

新虫 (初入文坛)

[交流] 梯度PCR的问题 已有7人参与

我的实验是扩细菌的一段基因，大概1700bp，我做了2次梯度PCR，虽然引物二聚体很严重，但都能扩出目的条带。当我从梯度PCR中选出最佳温度单独扩增，却只有引物二聚体没有目的条带，我的体系是25ul，引物0.3ul,引物浓度为10ul，酶0.4ul。快过年了，实验还是一塌糊涂，心中十分郁闷，求各位大虾都帮帮忙，出出招，感谢各位了
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心诚则灵
1楼 2013-01-20 14:46:46
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)
★
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那你直接用梯度PCR扩增，放在最佳的位置试试？
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XOooZzz
2楼2013-01-20 21:31:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
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"引物0.3ul,引物浓度为10ul"
这是咋整的？引物浓度是10μM？
PCR时的引物终浓度一般是0.1-1.0μM。你根据自己的stock算一下。
你PCR后需要用这个片段做克隆还是有什么其他目的。如果只是克隆的话，能P出来就直接往下做就可以了。如果是要优化条件去做定量什么的，引物不好是不行的。
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3楼2013-01-21 05:31:44
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672234993

金虫 (小有名气)
★
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我觉得你的模板还有PCR抑制剂，稀释模板的浓度试试看吧。
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我会回火星去的，别催我。。。。。。
4楼2013-01-21 07:52:40
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dongrh1981

金虫 (正式写手)
★
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长片段PCR不好做很正常，慢慢来，祝你成功
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呼吸的痛
5楼2013-01-21 11:10:05
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bubble1220

银虫 (小有名气)
★
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楼楼用的什么扩增酶？换个好点的，1700不困难
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6楼2013-01-21 12:43:22
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
2楼: Originally posted by dmzha at 2013-01-20 21:31:12
那你直接用梯度PCR扩增，放在最佳的位置试试？

赞同！而且最好保持做梯度时的反应体积。
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7楼2013-01-21 15:20:47
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resurgam

木虫 (著名写手)
★
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1、dNTP不要加太多，某人由于加多了怎么都P不出来或条带弱
2、GC含量？
3、加点DMSO试试（2% v/v）
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8楼2013-01-22 00:19:16
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