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celia2012铜虫 (小有名气)
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揪心的菌落PCR 已有2人参与
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几天挑选了单菌落，进行种属鉴定，做了17个菌落PCR，成功了11个，实验过程是：挑菌加入50微升无菌水，99度裂解5分钟，后冰浴五分钟，离心10分钟取上清液进行PCR,退火温度是55度，循环数35，25微升体系（加5微升模板） 后来继续挑选进行实验，问题不断，P出来的成功率低，不到一半，而且好多出现拖带现象，这在第一次实验中没出现过，后进行测序说是有杂合、结合现象，测序终止，立马心情受到影响了，做了大量的菌落PCR， 几天全浪费了~不知道是什么原因 1.由于我做的菌差异大，要一一摸条件好烦，有的浓度低了，有个又高了，难以控制，挑菌不知道挑多少合适 2.不知道做菌落PCR,是不是要将菌活化一下再挑，菌放在冰箱大概有20天了，菌放的时间长了是不是影响实验 3.退火温度如何确定，多少适合？是否循环数过高了 4.菌落PCR是否可靠？还是直接先提DNA适合？主要是我要做200个菌，提起来麻烦，现在看来菌落PCR也不简单？ 希望有经验的虫友们给点意见吧~万分感谢啊~纠结万恶的实验啊~  |
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reallpf
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【答案】应助回帖
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zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2012-08-10 16:21:22
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2012-08-10 16:21:22
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对于你的问题，我仅仅结合我做菌落PCR的情况，讨论一下你说的4个问题。 1.菌落PCR挑菌，不要总是挑一大团你看得见心里才放心，只需要牙签尖头轻轻刮一下即可，多了会影响PCR结果的。 2.平板放的时间越长，菌落PCR的结果越不准确，建议还是尽快做菌落PCR验证。但并不是说时间久就难P出来，而是结果不准确。因为4度菌是可以生长的。当然，我觉得没有活化的必要。本来时间就久，如果还活化，容易造成交叉污染。 3.退火温度最好是选择阳性对照做一个梯度PCR确定。如果你是通用引物，一般55度是没有问题的。当然你也可以根据公式算，算出来减小5到10度就可以了。 4.菌落PCR是可靠的，但是一般要结合其它的方法一起证明。你决定菌落PCR是因为你的平板放在4度，菌还在生长，特别是多次挑菌之后容易造成交叉污染。所以一般你的平板出来后，尽快做菌落PCR是没有问题的。在得到阳性结果后就马上划线到一个新的平板，保藏菌种。以免交叉污染影响后续试验，更让你怀疑菌落PCR的准确性。 简单交流，仅供参考。 |
11楼2012-08-10 16:05:29
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9楼2012-08-10 14:14:11
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10楼2012-08-10 15:08:10
