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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 揪心的菌落PCR
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celia2012

铜虫 (小有名气)

[求助] 揪心的菌落PCR已有2人参与

几天挑选了单菌落，进行种属鉴定，做了17个菌落PCR，成功了11个，实验过程是：挑菌加入50微升无菌水，99度裂解5分钟，后冰浴五分钟，离心10分钟取上清液进行PCR,退火温度是55度，循环数35，25微升体系（加5微升模板）
     后来继续挑选进行实验，问题不断，P出来的成功率低，不到一半，而且好多出现拖带现象，这在第一次实验中没出现过，后进行测序说是有杂合、结合现象，测序终止，立马心情受到影响了，做了大量的菌落PCR， 几天全浪费了~不知道是什么原因
1.由于我做的菌差异大，要一一摸条件好烦，有的浓度低了，有个又高了，难以控制，挑菌不知道挑多少合适
2.不知道做菌落PCR,是不是要将菌活化一下再挑，菌放在冰箱大概有20天了，菌放的时间长了是不是影响实验
3.退火温度如何确定，多少适合？是否循环数过高了
4.菌落PCR是否可靠？还是直接先提DNA适合？主要是我要做200个菌，提起来麻烦，现在看来菌落PCR也不简单？
希望有经验的虫友们给点意见吧~万分感谢啊~纠结万恶的实验啊~
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1楼2012-08-09 14:50:26
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2012-08-10 16:21:22
对于你的问题，我仅仅结合我做菌落PCR的情况，讨论一下你说的4个问题。
1.菌落PCR挑菌，不要总是挑一大团你看得见心里才放心，只需要牙签尖头轻轻刮一下即可，多了会影响PCR结果的。
2.平板放的时间越长，菌落PCR的结果越不准确，建议还是尽快做菌落PCR验证。但并不是说时间久就难P出来，而是结果不准确。因为4度菌是可以生长的。当然，我觉得没有活化的必要。本来时间就久，如果还活化，容易造成交叉污染。
3.退火温度最好是选择阳性对照做一个梯度PCR确定。如果你是通用引物，一般55度是没有问题的。当然你也可以根据公式算，算出来减小5到10度就可以了。
4.菌落PCR是可靠的，但是一般要结合其它的方法一起证明。你决定菌落PCR是因为你的平板放在4度，菌还在生长，特别是多次挑菌之后容易造成交叉污染。所以一般你的平板出来后，尽快做菌落PCR是没有问题的。在得到阳性结果后就马上划线到一个新的平板，保藏菌种。以免交叉污染影响后续试验，更让你怀疑菌落PCR的准确性。

简单交流，仅供参考。
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11楼2012-08-10 16:05:29
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阿博小硕士

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 啤酒泡沫 at 2012-08-09 19:25:59
貌似不行吧。我当时实验的时候，我老师要求带一条且足够亮，采用试剂盒回收。我做的是霉菌。你也可以试试。我11年5月份测序，好像一个样是15块，虽然物价上涨但也不会太多吧。...

你在哪测的？好便宜啊，我也是去年测的，一个序列30，一般一个菌种要正反测，就是60元。
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8楼2012-08-10 14:09:06
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啤酒泡沫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
celia2012: 金币+3 2012-08-09 19:09:59
zhang8826857: 金币+5, 鼓励新虫，正解 2012-08-10 10:15:47
我做过PCR,是先提取DNA，我做PCR是为了测序，鉴定菌株的。退火温度你可以查查，我记得是有公式的，根据DNA片段大小，可以算出退货温度的范围，然后你做个梯度PCR就能得到最适温度了。PCR的关键是退火温度，循环次数不太重要吧。
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2楼2012-08-09 17:50:37
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celia2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 啤酒泡沫 at 2012-08-09 17:50:37
我做过PCR,是先提取DNA，我做PCR是为了测序，鉴定菌株的。退火温度你可以查查，我记得是有公式的，根据DNA片段大小，可以算出退货温度的范围，然后你做个梯度PCR就能得到最适温度了。PCR的关键是退火温度，循环次数 ...

跑电泳结果是有拖带现象，带目的基因也是量的，这样去测序不行吧
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3楼2012-08-09 19:09:49
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啤酒泡沫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by celia2012 at 2012-08-09 19:09:49
跑电泳结果是有拖带现象，带目的基因也是量的，这样去测序不行吧...

貌似不行吧。我当时实验的时候，我老师要求带一条且足够亮，采用试剂盒回收。我做的是霉菌。你也可以试试。我11年5月份测序，好像一个样是15块，虽然物价上涨但也不会太多吧。
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4楼2012-08-09 19:25:59
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dgm1208

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+2, 鼓励 2012-08-10 10:15:59
亲，你的菌大体是什么菌啊？菌种鉴定就是扩16s呗，我做过，主要是放线菌和一些别的细菌。我的心得是：首先，要扩增的菌必须是活化后刚长出来的很嫩的菌（这点比较重要），只需要挑取少量，加20微升无菌水，水浴煮沸10min即可做模板了。我用的是50微升体系，扩增条件就是随便看了一篇外文文献上的扩增条件。关于你说的拖尾现象，只要有目的条带即可，因为现在的测序公司都是可以免费胶回收测序的。
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科研路艰辛···
5楼2012-08-10 09:43:29
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dgm1208

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
zhang8826857: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-10 10:16:12
另外，我在做的时候，有些第一遍可能p不出来，就再重新养一下，刚涨出来的时候再p一次，这样把你的那些做一遍之后，应该大部分都能p出来了，实在p不出来的，再去买试剂盒提一下DNA，再p···
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科研路艰辛···
6楼2012-08-10 09:53:33
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zqp9110

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人倾向于用Triton法快速提取纯菌DNA，代替菌落PCR，感觉效果不错，不喜欢用菌直接PCR。
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BEYOND
7楼2012-08-10 10:59:48
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阿博小硕士

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是先用试剂盒提的DNA，退火温度一般是采用梯度法，但是只要你的目的条带亮并且清晰就行，有杂带也没关系，测序公司可以免费提纯回收。而且菌要新鲜的。你做200个菌的工作量可够大的了，测序之后还得一个个比对分析。。。。祝你好运吧。。。
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9楼2012-08-10 14:14:11
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damaomao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
10楼2012-08-10 15:08:10
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