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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2012-08-10 16:21:22
对于你的问题,我仅仅结合我做菌落PCR的情况,讨论一下你说的4个问题。
1.菌落PCR挑菌,不要总是挑一大团你看得见心里才放心,只需要牙签尖头轻轻刮一下即可,多了会影响PCR结果的。
2.平板放的时间越长,菌落PCR的结果越不准确,建议还是尽快做菌落PCR验证。但并不是说时间久就难P出来,而是结果不准确。因为4度菌是可以生长的。当然,我觉得没有活化的必要。本来时间就久,如果还活化,容易造成交叉污染。
3.退火温度最好是选择阳性对照做一个梯度PCR确定。如果你是通用引物,一般55度是没有问题的。当然你也可以根据公式算,算出来减小5到10度就可以了。
4.菌落PCR是可靠的,但是一般要结合其它的方法一起证明。你决定菌落PCR是因为你的平板放在4度,菌还在生长,特别是多次挑菌之后容易造成交叉污染。所以一般你的平板出来后,尽快做菌落PCR是没有问题的。在得到阳性结果后就马上划线到一个新的平板,保藏菌种。以免交叉污染影响后续试验,更让你怀疑菌落PCR的准确性。

简单交流,仅供参考。
11楼2012-08-10 16:05:29
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chenxiang29

银虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zqp9110 at 2012-08-10 10:59:48
个人倾向于用Triton法快速提取纯菌DNA,代替菌落PCR,感觉效果不错,不喜欢用菌直接PCR。

life technologies很便宜
smile to the world
12楼2012-10-26 10:17:00
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1049131934

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以试着用试剂盒提一次质粒DNA,然后再做PCR看看,可能就能P出来了
13楼2013-06-14 20:26:36
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by dgm1208 at 2012-08-10 09:53:33
另外,我在做的时候,有些第一遍可能p不出来,就再重新养一下,刚涨出来的时候再p一次,这样把你的那些做一遍之后,应该大部分都能p出来了,实在p不出来的,再去买试剂盒提一下DNA,再p···

我也是 第一次能P出来,但是第二次就P不出来了,想不出来原因
14楼2014-04-29 11:28:31
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dgm1208

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-04-29 11:28:31
我也是 第一次能P出来,但是第二次就P不出来了,想不出来原因...

我看了你发的话题,不知道你的是什么菌哈,也不清楚你p的是哪个基因,一般菌落pcr我都是当天晚上转接一下平板,第二天早上挑一点那个刚长出来的,大部分都能p出来,像你说的,刚长出来的能p出来,又长了两天没p出来,我觉得很正常啊,多长了两天,菌变得皮厚了就不好p了,就和提DNa一样,提DNA的时候也是要用新鲜的菌体,这样壁薄,好破壁,好提···
科研路艰辛···
15楼2014-04-29 12:44:03
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by dgm1208 at 2014-04-29 12:44:03
我看了你发的话题,不知道你的是什么菌哈,也不清楚你p的是哪个基因,一般菌落pcr我都是当天晚上转接一下平板,第二天早上挑一点那个刚长出来的,大部分都能p出来,像你说的,刚长出来的能p出来,又长了两天没p出来 ...

是梭菌,目的片段是在基因组上。其实我的平板放的时间也不久啊,就多长了两天而已,菌落变大了,那就再活化下试试吧,如果还是那样的问题就真的没辙了,需要重新做转化。。。
16楼2014-04-29 16:00:56
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dgm1208

银虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-04-29 16:00:56
是梭菌,目的片段是在基因组上。其实我的平板放的时间也不久啊,就多长了两天而已,菌落变大了,那就再活化下试试吧,如果还是那样的问题就真的没辙了,需要重新做转化。。。...

恩 试试吧 祝你成功
科研路艰辛···
17楼2014-05-07 09:34:01
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