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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 揪心的菌落PCR
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2012-08-10 16:21:22
对于你的问题，我仅仅结合我做菌落PCR的情况，讨论一下你说的4个问题。
1.菌落PCR挑菌，不要总是挑一大团你看得见心里才放心，只需要牙签尖头轻轻刮一下即可，多了会影响PCR结果的。
2.平板放的时间越长，菌落PCR的结果越不准确，建议还是尽快做菌落PCR验证。但并不是说时间久就难P出来，而是结果不准确。因为4度菌是可以生长的。当然，我觉得没有活化的必要。本来时间就久，如果还活化，容易造成交叉污染。
3.退火温度最好是选择阳性对照做一个梯度PCR确定。如果你是通用引物，一般55度是没有问题的。当然你也可以根据公式算，算出来减小5到10度就可以了。
4.菌落PCR是可靠的，但是一般要结合其它的方法一起证明。你决定菌落PCR是因为你的平板放在4度，菌还在生长，特别是多次挑菌之后容易造成交叉污染。所以一般你的平板出来后，尽快做菌落PCR是没有问题的。在得到阳性结果后就马上划线到一个新的平板，保藏菌种。以免交叉污染影响后续试验，更让你怀疑菌落PCR的准确性。

简单交流，仅供参考。
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11楼2012-08-10 16:05:29
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zqp9110 at 2012-08-10 10:59:48
个人倾向于用Triton法快速提取纯菌DNA，代替菌落PCR，感觉效果不错，不喜欢用菌直接PCR。

life technologies很便宜
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smile to the world
12楼2012-10-26 10:17:00
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1049131934

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以试着用试剂盒提一次质粒DNA，然后再做PCR看看，可能就能P出来了
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13楼2013-06-14 20:26:36
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by dgm1208 at 2012-08-10 09:53:33
另外，我在做的时候，有些第一遍可能p不出来，就再重新养一下，刚涨出来的时候再p一次，这样把你的那些做一遍之后，应该大部分都能p出来了，实在p不出来的，再去买试剂盒提一下DNA，再p···

我也是 第一次能P出来，但是第二次就P不出来了，想不出来原因
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14楼2014-04-29 11:28:31
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dgm1208

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-04-29 11:28:31
我也是 第一次能P出来，但是第二次就P不出来了，想不出来原因...

我看了你发的话题，不知道你的是什么菌哈，也不清楚你p的是哪个基因，一般菌落pcr我都是当天晚上转接一下平板，第二天早上挑一点那个刚长出来的，大部分都能p出来，像你说的，刚长出来的能p出来，又长了两天没p出来，我觉得很正常啊，多长了两天，菌变得皮厚了就不好p了，就和提DNa一样，提DNA的时候也是要用新鲜的菌体，这样壁薄，好破壁，好提···
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科研路艰辛···
15楼2014-04-29 12:44:03
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by dgm1208 at 2014-04-29 12:44:03
我看了你发的话题，不知道你的是什么菌哈，也不清楚你p的是哪个基因，一般菌落pcr我都是当天晚上转接一下平板，第二天早上挑一点那个刚长出来的，大部分都能p出来，像你说的，刚长出来的能p出来，又长了两天没p出来 ...

是梭菌，目的片段是在基因组上。其实我的平板放的时间也不久啊，就多长了两天而已，菌落变大了，那就再活化下试试吧，如果还是那样的问题就真的没辙了，需要重新做转化。。。
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16楼2014-04-29 16:00:56
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dgm1208

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-04-29 16:00:56
是梭菌，目的片段是在基因组上。其实我的平板放的时间也不久啊，就多长了两天而已，菌落变大了，那就再活化下试试吧，如果还是那样的问题就真的没辙了，需要重新做转化。。。...

恩 试试吧 祝你成功
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科研路艰辛···
17楼2014-05-07 09:34:01
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