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tsuei428

银虫 (小有名气)

[交流] 总dna电泳有条带，但PCR后只有引物二聚体

提取总dna后直接电泳有条带（如图），但PCR后电泳却只有引物二聚体。请教各位是何缘故。PCR参数：50ul体系，buffer（5ul），Mg2+（2ul），DMSO（2.5ul），2.5mM dNTP（4ul），20uM ITS1-F（4ul），20uM ITS4-R（4ul），总dna（1ul），taq酶（1ul），水（26.5）

pcr后电泳图



总DNA直接电泳图
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1楼 2012-07-15 14:15:51
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回帖置顶 ( 共有5个 )

Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★
tsuei428(金币+2): 谢谢参与
两者之间有什么关系啊？只能说明你没P出来而已，引物确定没问题就提高退火温度。
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2楼2012-07-15 19:36:50
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j2

木虫 (正式写手)
★
tsuei428(金币+2): 谢谢参与
降低退火温度吧。。。
不加二甲亚砜试过没有，有结果不？或者降低一点二甲亚砜的浓度。二甲亚砜对酶活性有影响的。
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3楼2012-07-15 20:52:02
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yjqhades

禁虫 (初入文坛)
★
tsuei428(金币+2): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
5楼2012-07-15 23:29:55
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84146922

金虫 (小有名气)
★
tsuei428(金币+2): 谢谢参与
这样应该是退货温度问题，建议进行梯度PCR，然后减少模板量。
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6楼2012-07-16 08:34:33
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reallpf

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
mengfei8336: 金币+10, 谢谢关注。 2012-07-16 20:15:30
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-16 20:16:01
补充一下：
一般PCR没有目标条带的时候，可能有下列原因：
1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策:
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间
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11楼2012-07-16 14:21:37
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liujianmin68

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-16 13:52:18
其实一般做pcr的时候，是不需要加二甲亚砜的，另外，如果你有条件，建议你将你的dna进行纯化一下，还有，你的dntp的量也可以少加一些，加的太多引物二聚体就会很亮。你的退火温度是多少？降低退火温度试试
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7楼2012-07-16 08:45:44
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jl860822

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 这位虫虫，是淘宝客啊，鼓励交流 2012-07-16 13:52:49
亲，你是不是模板加的太多了，需要对你的模板进行稀释的，看你那DNA的话，怎么着也得稀释50-100倍，然后就是需要降低退火温度，不是提高，多试试，肯定是你的PCR出了问题
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8楼2012-07-16 08:49:55
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王礼鹏

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-16 13:53:02
建议进行退火温度梯度PCR，减少点模板量，PCR时加DMSO好像没什么用吧，再说它对酶的活性是有一定的影响的。不是特别需要的话可以不加。
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9楼2012-07-16 12:14:52
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reallpf

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
个人意见：你的模版量太大了，一般提得总DNA都要稀释50倍后再用。另外至右引物二聚体，没有杂带，这是明显的退火温度高了的问题，所以建议降低退火温度。如果有条件做touch down PCR最好了，一般的都是一次就出来。
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10楼2012-07-16 14:15:06
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tsuei428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-16 08:49:55
亲，你是不是模板加的太多了，需要对你的模板进行稀释的，看你那DNA的话，怎么着也得稀释50-100倍，然后就是需要降低退火温度，不是提高，多试试，肯定是你的PCR出了问题

退火温度53，55都试过，都没跑出来。摸板量太大吗？我一直以为是摸板浓度低了，才加了1ul。3q~还有，引物二聚体那么多是不是得降低引物浓度呢？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2012-07-17 08:27:51
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tsuei428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-16 14:15:06
个人意见：你的模版量太大了，一般提得总DNA都要稀释50倍后再用。另外至右引物二聚体，没有杂带，这是明显的退火温度高了的问题，所以建议降低退火温度。如果有条件做touch down PCR最好了，一般的都是一次就出来。

谢谢，那引物的量是不是加多了呢？我看有些人做的好像引物和摸板的量都加2ul

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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13楼2012-07-17 08:29:58
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tsuei428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liujianmin68 at 2012-07-16 08:45:44
其实一般做pcr的时候，是不需要加二甲亚砜的，另外，如果你有条件，建议你将你的dna进行纯化一下，还有，你的dntp的量也可以少加一些，加的太多引物二聚体就会很亮。你的退火温度是多少？降低退火温度试试

请问如何进行dna纯化？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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14楼2012-07-17 08:31:41
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reallpf

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by tsuei428 at 2012-07-17 08:29:58
谢谢，那引物的量是不是加多了呢？我看有些人做的好像引物和摸板的量都加2ul
...

这个其实需要你自己去实验，因为引物大家配的浓度也不同。不过2uL和4uL我觉得应该不会有很大的差别。当然，你也可以适当减少再PCR试试看。
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15楼2012-07-17 08:43:33
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by tsuei428 at 2012-07-17 08:27:51
退火温度53，55都试过，都没跑出来。摸板量太大吗？我一直以为是摸板浓度低了，才加了1ul。3q~还有，引物二聚体那么多是不是得降低引物浓度呢？
...

建议做个梯度得了，应该可以做出来的
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16楼2012-07-17 08:45:01
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tsuei428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-17 08:45:01
建议做个梯度得了，应该可以做出来的...

弱弱地问下，摸板稀释50倍的话是用TEbuffer溶解稀释吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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17楼2012-07-17 08:46:38
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by tsuei428 at 2012-07-17 08:46:38
弱弱地问下，摸板稀释50倍的话是用TEbuffer溶解稀释吗？
...

不用，用灭菌水稀释，TE中的EDTA会对酶活有抑制作用的
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18楼2012-07-17 09:52:31
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tsuei428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-17 08:43:33
这个其实需要你自己去实验，因为引物大家配的浓度也不同。不过2uL和4uL我觉得应该不会有很大的差别。当然，你也可以适当减少再PCR试试看。...

PCR条件：
94℃    3min
94℃    30s
53℃    30s
72℃    1min  
30circle
72   10min
这样设计有问题吗
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19楼2012-07-17 09:59:49
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reallpf

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by tsuei428 at 2012-07-17 09:59:49
PCR条件：
94℃    3min
94℃    30s
53℃    30s
72℃    1min  
30circle
72   10min
这样设计有问题吗...

程序我觉得是没有问题的。不过预变性可以考虑下95度5min（因为你的是基因组吧？）。其它的我觉得可以根据电泳结果再做调整。
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20楼2012-07-17 10:04:30
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tsuei428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-17 10:04:30
程序我觉得是没有问题的。不过预变性可以考虑下95度5min（因为你的是基因组吧？）。其它的我觉得可以根据电泳结果再做调整。...

好的  谢谢
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21楼2012-07-17 10:16:13
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tsuei428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-17 09:52:31
不用，用灭菌水稀释，TE中的EDTA会对酶活有抑制作用的...

多谢~
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22楼2012-07-17 12:49:36
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jiao什么

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
跟我们现在的情况好像啊，也是dna有条带，pcr之后就是这样的，试了好多次，都没有，急死了，怎么破啊。。。
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23楼2014-04-17 22:18:16
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阳光拐角处

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主后来做成功了吗？实验室遇到同样的问题，求分享经验
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24楼2016-12-05 14:52:32
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简单回复
strive1231234楼
2012-07-15 21:55   回复  
tsuei428(金币+2): 谢谢参与
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