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tsuei428

银虫 (小有名气)

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[交流] 总dna电泳有条带，但PCR后只有引物二聚体

提取总dna后直接电泳有条带（如图），但PCR后电泳却只有引物二聚体。请教各位是何缘故。PCR参数：50ul体系，buffer（5ul），Mg2+（2ul），DMSO（2.5ul），2.5mM dNTP（4ul），20uM ITS1-F（4ul），20uM ITS4-R（4ul），总dna（1ul），taq酶（1ul），水（26.5）

pcr后电泳图

总DNA直接电泳图

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1楼 2012-07-15 14:15:51

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reallpf

木虫 (正式写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

个人意见：你的模版量太大了，一般提得总DNA都要稀释50倍后再用。另外至右引物二聚体，没有杂带，这是明显的退火温度高了的问题，所以建议降低退火温度。如果有条件做touch down PCR最好了，一般的都是一次就出来。

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10楼2012-07-16 14:15:06

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reallpf

木虫 (正式写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
mengfei8336: 金币+10, 谢谢关注。 2012-07-16 20:15:30
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-16 20:16:01

补充一下：
一般PCR没有目标条带的时候，可能有下列原因：
1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策:
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间

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11楼2012-07-16 14:21:37

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