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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助PCR老是跑不出条带
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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR老是跑不出条带

我跑PCR跑了好几次，只有一次出过条带。试剂都是新买的，加样也没有错。不知哪里出了问题。引物用的16s RDNA通用引物5’-TACCTTGTTACGACTT- 3’ 和5’-AGAGTTTGATCATGGC-3，复性温度用的40度。（曾做过42,44,46,48,50的温度梯度也没有条带）我把那个唯一出条带的电泳图和总DNA也发上来了。求高手指点！必谢！还有几天就毕业了，还没有做完实验，很着急，求大师指点！
是不是复性温度不够好？文献上用的比较长的F27和R1492引物是57度，我那两条引物的Tm分别是48和44，因为做梯度也没出结果，就自己设了个40度。
不知表述清楚没有，谢谢了。




[ Last edited by 1949stone on 2011-6-2 at 15:56 ]
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1楼 2011-06-02 14:00:48
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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)
第一个是16S的，第二个是总DNA的。
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2楼2011-06-02 14:02:45
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healerly

禁虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1): 的确有很多疑问啊 2011-06-02 14:55:51
本帖内容被屏蔽
3楼2011-06-02 14:11:19
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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)
25微的体系加了2微（有时也加1.5）。模板太多了是不是会使PCR背景变深啊。太多了也会影响扩增效果吗？
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4楼2011-06-02 14:27:18
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 厉害 2011-06-02 14:55:03
一枝清秀8611(金币+3): 复性温度不是应该比Tm低4-5度么？ 2011-06-04 13:36:51
内容已删除
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-06-02 14:53:45
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healerly

禁虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-06-04 19:05:01
本帖内容被屏蔽
6楼2011-06-02 15:25:19
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
一枝清秀8611(金币+3): 好吧，我换换酶再做做吧。不知道行不行。这个酶是新买的，而且别的小组也用这套酶都P出东西了。难道这个Taq酶还有DNA的特异性？ 2011-06-04 13:39:28
dhd997(金币+2): good 2011-06-04 19:05:17
你P的这种条带我也P出过。
我用普通酶P成这样的弥散。然后换高保真后就没问题了。
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7楼2011-06-02 17:20:54
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d1emon

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一枝清秀8611(金币+2): 恩，谢谢。我去试试 2011-06-04 13:44:57
解决方法：
1. 从你跑的较好的DNA中选择一个稀释一下做模板
2.退火温度设一个梯度如45,50，55三个即可，延伸时间1min即可
3.问别的实验室借套酶（别人用过没有问题的）再做一次
祝好运！
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8楼2011-06-02 18:06:32
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
我也遇到过同样的问题，老是P出来一片，看不出特异性。请问是模板浓度的问题吗？
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9楼2011-06-02 18:56:30
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周梦怡

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
一枝清秀8611(金币+2): 恩，也许是有些多了。你的57 度是F27和R1492引物吧 2011-06-04 13:44:39
dhd997(金币+2): good 2011-06-04 19:05:28
引用回帖:
Originally posted by 一枝清秀8611 at 2011-06-02 14:27:18:
25微的体系加了2微（有时也加1.5）。模板太多了是不是会使PCR背景变深啊。太多了也会影响扩增效果吗？

模板太多了 很可能那16S的刷子是来源你模板 我也碰到这情况 当时我是20加1 后来改为20加0.5 就出现带了
温度的话 建议你做个温度梯度 我用的温度是57度
还有 一定要确保你提的DNA够纯 不存在PCR抑制剂
祝你好运 这PCR有时真看运气
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10楼2011-06-04 13:05:51
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