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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR老是跑不出条带

我跑PCR跑了好几次,只有一次出过条带。试剂都是新买的,加样也没有错。不知哪里出了问题。引物用的16s RDNA通用引物5’-TACCTTGTTACGACTT- 3’ 和5’-AGAGTTTGATCATGGC-3,复性温度用的40度。(曾做过42,44,46,48,50的温度梯度也没有条带)我把那个唯一出条带的电泳图和总DNA也发上来了。求高手指点!必谢!还有几天就毕业了,还没有做完实验,很着急,求大师指点!
是不是复性温度不够好?文献上用的比较长的F27和R1492引物是57度,我那两条引物的Tm分别是48和44,因为做梯度也没出结果,就自己设了个40度。
不知表述清楚没有,谢谢了。




[ Last edited by 1949stone on 2011-6-2 at 15:56 ]
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d1emon

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一枝清秀8611(金币+2): 恩,谢谢。我去试试 2011-06-04 13:44:57
解决方法:
1. 从你跑的较好的DNA中选择一个稀释一下做模板
2.退火温度设一个梯度如45,50,55三个即可,延伸时间1min即可
3.问别的实验室借套酶(别人用过没有问题的)再做一次
祝好运!
8楼2011-06-02 18:06:32
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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)

第一个是16S的,第二个是总DNA的。
2楼2011-06-02 14:02:45
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healerly

禁虫 (小有名气)


1949stone(金币+1): 的确有很多疑问啊 2011-06-02 14:55:51
本帖内容被屏蔽

3楼2011-06-02 14:11:19
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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)

25微的体系加了2微(有时也加1.5)。模板太多了是不是会使PCR背景变深啊。太多了也会影响扩增效果吗?
4楼2011-06-02 14:27:18
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