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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助PCR老是跑不出条带
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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR老是跑不出条带

我跑PCR跑了好几次，只有一次出过条带。试剂都是新买的，加样也没有错。不知哪里出了问题。引物用的16s RDNA通用引物5’-TACCTTGTTACGACTT- 3’ 和5’-AGAGTTTGATCATGGC-3，复性温度用的40度。（曾做过42,44,46,48,50的温度梯度也没有条带）我把那个唯一出条带的电泳图和总DNA也发上来了。求高手指点！必谢！还有几天就毕业了，还没有做完实验，很着急，求大师指点！
是不是复性温度不够好？文献上用的比较长的F27和R1492引物是57度，我那两条引物的Tm分别是48和44，因为做梯度也没出结果，就自己设了个40度。
不知表述清楚没有，谢谢了。




[ Last edited by 1949stone on 2011-6-2 at 15:56 ]
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1楼 2011-06-02 14:00:48
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
我也遇到过同样的问题，老是P出来一片，看不出特异性。请问是模板浓度的问题吗？
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9楼2011-06-02 18:56:30
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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)
第一个是16S的，第二个是总DNA的。
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2楼2011-06-02 14:02:45
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healerly

禁虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1): 的确有很多疑问啊 2011-06-02 14:55:51
本帖内容被屏蔽
3楼2011-06-02 14:11:19
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一枝清秀8611

铜虫 (小有名气)
25微的体系加了2微（有时也加1.5）。模板太多了是不是会使PCR背景变深啊。太多了也会影响扩增效果吗？
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4楼2011-06-02 14:27:18
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