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elalei1999

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[交流] 怎么扩不出来已有1人参与

本人从植物叶片中提取RNA,跑胶的条带还可以，反转录后，扩Actin看家基因有正确的电泳条带，但是在扩目的基因的时候什么都跑不出来，只有引物的二聚体出现，两个引物的Tm值分别为54和64。曾用50--60的退火温度扩增。
求大家给支招，是退火温度的问题，还是RNA降解，难道是引物设计不对？
困惑中........求解。谢大伙！！

[ Last edited by amisking on 2010-8-14 at 22:27 ]

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1楼2009-11-27 10:18:00

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ljwei_163

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两条引物的Tm值相差有点大啊.
有二聚体说明试剂没问题

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2楼2009-11-27 11:17:19

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zhangsuobing

银虫 (小有名气)

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把你的照片传上来看看! PCR时,模板加了多少,扩了多少个循环?
建议从以下几个方面查一下原因:
1. 若actin扩的很好,先查一下你的基因表达时期和部位(基因表达有时空特异性),看看你的取样时期和部位有无问题.若无问题,增大一下循环数,同时做一下温度梯度或降落看看.实在不行就重新设计引物,我以前遇到过类似问题.
2.若actin扩的都不亮,就重新反转吧.

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3楼2009-11-27 11:25:16

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liyong1981

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1949stone(金币+4,VIP+0):谢谢交流 11-27 16:33

建议：1，引物多设计几对，尽量退火温度不要差太多
2.跑梯度，这事做反转录必须的！
3.Actin能扩出来，基本不能说明问题。因为肌动蛋白本身是个基因家族，总RNA降解一点和不降解对其影响不大
4.你确定你的基因在你取材的时间和空间（即部位）是表达的么？这点也很重要
5.个人感觉你引物的问题比较大，多跑几对吧，有目的条带后，如引物二聚体仍严重，需要提高Mg浓度，当然，这是后话，引物设计建议你结合primer5和ｏｌｉｇｏｄＴ６。０仪器使用，各有千秋
希望对你有所帮助

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4楼2009-11-27 11:37:17

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