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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎么扩不出来
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elalei1999

铜虫 (小有名气)

[交流] 怎么扩不出来 已有1人参与

本人从植物叶片中提取RNA,跑胶的条带还可以，反转录后，扩Actin看家基因有正确的电泳条带，但是在扩目的基因的时候什么都跑不出来，只有引物的二聚体出现，两个引物的Tm值分别为54和64。曾用50--60的退火温度扩增。
求大家给支招，是退火温度的问题，还是RNA降解，难道是引物设计不对？
困惑中........求解。谢大伙！！

[ Last edited by amisking on 2010-8-14 at 22:27 ]
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不抛弃，不放弃！
1楼 2009-11-27 10:18:00
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ljwei_163

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-27 16:33
两条引物的Tm值相差有点大啊.
有二聚体说明试剂没问题
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2楼2009-11-27 11:17:19
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zhangsuobing

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+4,VIP+0):谢谢交流 11-27 16:33
把你的照片传上来看看! PCR时,模板加了多少,扩了多少个循环?
建议从以下几个方面查一下原因:
1. 若actin扩的很好,先查一下你的基因表达时期和部位(基因表达有时空特异性),看看你的取样时期和部位有无问题.若无问题,增大一下循环数,同时做一下温度梯度或降落看看.实在不行就重新设计引物,我以前遇到过类似问题.
2.若actin扩的都不亮,就重新反转吧.
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3楼2009-11-27 11:25:16
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liyong1981

金虫 (正式写手)
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1949stone(金币+4,VIP+0):谢谢交流 11-27 16:33
建议：1，引物多设计几对，尽量退火温度不要差太多
2.跑梯度，这事做反转录必须的！
3.Actin能扩出来，基本不能说明问题。因为肌动蛋白本身是个基因家族，总RNA降解一点和不降解对其影响不大
4.你确定你的基因在你取材的时间和空间（即部位）是表达的么？这点也很重要
5.个人感觉你引物的问题比较大，多跑几对吧，有目的条带后，如引物二聚体仍严重，需要提高Mg浓度，当然，这是后话，引物设计建议你结合primer5和ｏｌｉｇｏｄＴ６。０仪器使用，各有千秋
希望对你有所帮助
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4楼2009-11-27 11:37:17
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shenye.judy

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 11-27 16:33
不知道你的产物有多长？如果很长可能是比较难扩，特别是RNA冻融过的。如果是全长基因就要用Oligo dT做反转。还有就像楼上说的，该基因你确定是表达的吗？
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5楼2009-11-27 11:39:24
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harris

铜虫 (初入文坛)

植物组织中纤维素的测定

★
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用20ml60%硫酸溶液与25mg纯纤维素冰浴，为什么纤维素不能完全溶解？
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6楼2009-11-27 19:10:23
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
★
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模板浓度有问题，高一丁点都扩不出来，之前我遇到过同样的问题，扩了半年都没扩出来，后来测了模板浓度，算成体积，按说明书上一般加0.1——1微克的量，都扩的出来
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
7楼2010-08-14 20:50:34
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
★
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退火温度按引物合成说明书上来，一般没问题，不需要做梯度，引物按要求加，波动一点也没问题，但模板的浓度一定不能太高或太低
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
8楼2010-08-14 20:53:09
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